Estudio Preliminar de "Macrodontina", una Nueva Cisteinilproteinasa Aislada de Frutos de Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae)


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1 Acta Farm. Bonaerense 13 (1): 41-7 (1994) Recibido el 4 de abril de 1994 Aceptado el 17 de mayo de 1994 Trabajos originales Estudio Preliminar de "Macrodontina", una Nueva Cisteinilproteinasa Aislada de Frutos de Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae) Adriana BRULLO, Rosana M. HILAL, Claudia L. NATALUCCI* y Néstor O. CAFFINI* LIPROVE, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de La Plata, Casilla de Correo 71 1,1900 La Plata, Argedna RESUMEN. De los frutos semimaduros del "ihvirá" (Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae) se ha logrado aislar y caracterizar parcialmente una proteasa sulfñidrilica ("macrodontina") con actividad destacada entre ph 7 y 10. Las preparaciones parcialmente purificadas (precipitados acetónicos) son relativamente estables a temperaturas inferiores a 45 O C y no se alteran por congelamiento o liofilización. Una ulterior purificación por cromatografia de intercambio aniónico (DEAE- Sepharose Fast Flow) permite detectar dos fracciones activas, que son bien resueltas por cromatografia de exclusión molecular (Sephadex (3-75). Por electroforesis (SDS- PACE) del precipitado acetónico se detectan seis fracciones proteicas (entre 14 y 67 kda), pero el zimograma revela que sólo tres de ellas tienen actividad caseinolítica, de pesos moleculares de alrededor de 27,30 y 54 kda. SUMMARY. "Preliminary Study of "Macrodontin", a New Cysteinilproteinase isolated from Fruits of Pseugknanas nulcrvdontes (Morr.) H ms (Bromeliaceae)". From inmature fruits of Pseudananas nzacrodontes (Morr.) Harms, known as "ihvirá" in the northeast of Argentina, has been isolated and partially characterized a sulfhydril-protease highly active between ph 7 and 10. The acetonic precipitates are quite stable at temperatures below 45 OC and not affected by freezing or liophylization. Anionic exchange chromatography (DEAE-Sepharose Fast Flow) affords two active fractions, both well resolved by gel filtration (Sephadex G-75). The electrophoretic pattern (SDS-PAGE) of the acetonic precipitate shows six protein fractions, between 14 and 67 kda, but the zymogram reveals the presente of three active fractions, of about 27,30, arid 54 kda. INTRODUCQON Las principales aplicaciones farrnacológicas de las proteasas han estado relacionadas con el tratamiento de parasitosis intestinales, trastornos digestivos y procesos inflamatorios 1. Más recientemente se ha comunicado una presunta acción citostática de bromelina 2 y el uso de quimopapaína en la terapéutica de las hernias de disco intervertebrales 3. PALABRAS CLAVE: Fitoproteasas, Proteinasas, Macrodontina, Pseudananas macrodon-. tes, Bronzeliaceae, Purificación de Enzimas. KEY WORDS: Plant Proteases, Proteinases, Macrodontin, Pseudananas macrodontes, Bro- nzeliaceae. Enzvme Purification... * Miembros de la Carrera del Investigador. Coniisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, Argentina ISSN

2 Bmiio, A., R.M. Hilal, C.L. Natalucci y N.O. Caffini Las Bromeliaceae constituyen una de las pocas familias de plantas superiores caracterizadas por poseer proteasas en cantidades superiores a las fisiológicamente necesarias, razón por la cual muchas de sus especies han sido estudiadas en tal sentido. La representante más conspicua (a su vez la más usada en farmacoterapia) es la bromelina 4, obtenida partir de tallos y frutos del ananá (Ananas comosus (L.) Merrill), pero también se han aislado y caracterizado proteasas de los frutos de Bromelia pinguin L.5,6, B. plumier? (B. karatas) 7-9, B. sylvestrls 7.8, B. hernlsphertca 7,8, B. palmer?7,8, B. sena Griseb. '0, B. balansae Mez 11, B. hieronymi Mez 12 y B. laciniosa Mart. 13. En el presente trabajo se comunica el aislamiento y caracterización parcial de "macrodontina", una enzima sulfhidrílica obtenida a partir de frutos semimaduros de Fseudananas macrodontes (Morr.) Harms. MATERIALES Y METODOS Materiul vegetal Se utilizaron frutos bien desarrollados pero no totalmente maduros de Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae), conocido como "ihvirá". El material estudiado fue recolectado por el Dr. Aníbal G. Amat en mayo de 1993 en Santa Ana, Departamento de Candelaria (Pcia. de Misiones, Argentina), y conservado a -20 OC hasta su procesamiento. P. macrodontes es una planta terrestre, estolonífera, provista de numerosas hojas arrosetadas, largas y armadas de aguijones en los márgenes y ápices. Los frutos (sincarpios) son de menor tamaño que el ananá (10 a 15 cm de largo), amarillentos cuando maduran, aromáticos y comestibles, aunque fibrosos, y las hojas y estolones suministran fibra textil 14. ObtencMn del extracto cm& Todas las etapas de extracción y purificación se llevaron a cabo a 0-4 "C. Los frutos congelados (50 g) se trozaron y procesaron durante 1 min en una trituradora doméstica en presencia de buffer fosfatos 0,l M de ph 6 de ph 6 (250 ml) conteniendo cisteína y EDTA 5 mm. El triturado se filtró sobre una gasa doble para eliminar los restos vegetales y se centrifugó a g durante 30 min. Precipitación acetdnica fracdqnada Al extracto crud; obtenido en el paso anterior se le adicionó lentaniente 1 vol de acetona fría (-20 OC) y se centrifugó a g durante 30 rnin, desechando el precipitado. Al sobrenadante se le agregaron dos volúmenes de acetona y se centrifugó en las mismas condiciones. El precipitado obtenido se redisolvió en agua destilada y se liofilizó, previa eliminación de los restos de acetona por aplicación de vacío. Determinación de la actk~idad case2trolztica La mezcla de reacción estuvo compuesta por 1,l 1111 de solución de caseína (tipo Hammarsten) al 1%, conteniendo cisteína 12 mm y 0,l m1 de solución de la enzima, ambas en buffer fosfatos 0,l M de ph 8,O. La reacción fue llevada a cabo

3 acta farmacéutica bonaerense - vol. 13 no 1 - año 1994 a 37 OC y detenida por la adición de 1,8 m1 de ácido tricloroacético al 5%, luego de lo cual los tubos fueron centrifugados a g durante 20 minutos, determinándose la absorbancia de los sobrenadantes a 280 nin. Para expresar la actividad proteolítica se definió una unidad arbitraria (Unidad caseinolítica, U,,>, que corresponde a la cantidad de enzima que produce un incremento de una unidad de absorbancia por minuto en las condiciones de ensayo. DeterminucMn &l contenido de protefnas e hidratos de carbono solubks El contenido total de proteínas fue determinado por el método de Bradfordl5, usando seroalbúmina bovina como estándar. En todos los procedimientos cromatográficos la concentración de proteína se estimó por medida de la absorbancia directa a 280 nm. El contenido de hidratos de carbono se determinó por el método de Dubois et al. 16. Efecto &lph sobre la acttvidudproteolítica Para obtener el perfil de ph se utilizó caseína en las condiciones antes indicadas, preparada en soluciones 0,1 M de los siguientes buffers: MES, MOPS, TAPS, AMPSO y CAPS '6 en un rango de ph 5,5 a 10,O. Estabilidad térmtca Con el objeto de determinar el efecto de la temperatura sobre la preparación enzirnática, soluciones de las mismas fueron mantenidas durante 5, 10, 20, 40, 60, 90 y 120 iiiinutos a 17 OC, 37 OC, 45 "C y 65 OC y luego se midió la actividad caseinolítica residual. Cromatografia & ititercambio Mtrico El liofilizado redisuelto en agua destilada se sembró en una columna de DE- AE-Sepharose Fast Flow (1,5 cm x 30 cm), se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0,O - 0,4 M) en buffer Tris-C1H 0,05 M (ph 8,O) a una velocidad de flujo de 17 cm.h-1 y se recolectaron fracciones de 2,2 ml. La actividad caseinolítica fue determinada luego de 10 min de incubación a 37 "C. Cromatografla & exclusión rnolecular El contenido de los-tubos correspondientes a la principal fracción proteolítica se reunió y precipitó con 3 volúmenes de acetona. El precipitado redisuelto en agua se sembró en una columna de Sephadex G-75 (1,5 cm x 30 cm), eluyendo con buffer Tris-C1H 0,2 M (ph 8,O) a una velocidad de flujo de 9,4 c1ii.h-1. La actividad caseinolítica fue determinada luego de 10 min de incubación a 37 "C. El precipitado acetónico redisuelto en agua se sometió a electroforesis en gel de poliacrila~iiida (12%) en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) 1s. El electroforetograrna obtenido fue posteriormente puesto en contacto con un gel de agarosa recubierto superficialniente con caseína e incubado a 60 "C durante 60 iiiin a efectos de detectar las fracciones proteolíticamente activas 19.

4 Bmiio, A., R.M. Hilal, C.L. Natalucci y N.O. Caffini RESULTADOS Y DISCUSION Los frutos de "ihvirá" estudiados pesan entre 300 y 350 g. El extracto crudo contiene 0,98 mg de proteínas, 9,83 Ing de azúcares y una actividad caseinolítica equivalente a 10,73 U, por gramo de frutos. Dado el elevado contenido de azúcares y la presencia de pigmentos, el extracto crudo fue sornetido a una purificación inicial por tratamiento con distintas cantidades de acetona, de acuerdo al procedimiento descripto en un trabajo anterior 20. La Tabla 1 muestra los resultados del tratamiento acetónico. El agregado de un volumen de solvente orgánico genera un precipitado (P-1) que contiene el 34,9% de las proteínas presentes en el extracto crudo, pero casi desprovistas de actividad proteolítica (3,9% de la actividad inicial) y el 17,8% de los glúcidos extraíbles de los frutos. El agregado de otro volumen de acetona al sobrenadante obtenido al separar P-1 produce un segundo precipitado (P-21, menos rico en proteínas (10,3%) pero con elevada actividad proteolítica (40,4 % de la actividad inicial) y con menor contenido de azúcares (63%). Al agregar un tercer volumen de acetona al sobrenadante obtenido luego de separar P-2 se consigue un tercer precipitado (P-3) con mayor contenido en proteínas que el anterior (16,2%) pero con nienor actividad proteolítica (28,3 % de la actividad inicial) y con ínfimo contenido de azúcares (0,6%). El análisis de estos resultados definió el esquema inicial de purificación. Dado que la actividad caseinolítica de P-1 es despreciable, el mismo fue desechado. P-2 es el que posee la mayor actividad específica, en tanto que P-3, si bien con menor actividad específica, retiene más de la cuarta parte de la actividad del extracto crudo, por lo que finalmente se decidió seguir el procedimiento indicado en Materiales y Métodos, que permite obtener un precipitado acetónico (P-2 + P-3) que contiene un 26,5% de las proteínas y un 68,7% de la actividad inicial, con sólo un 7,4% de los glúcidos, lo que implica un grado de purificación de 2,6 veces. El agregado de cisteína al medio de reacción mejora sensiblemente la actividad caseinolítica de la enzima, siendo máxima cuando la concentración de cisteína es de 12 mm. Por su parte ni el fluoruro de fenilnietilsulfonilo (PMSF) ni el ED- TA afectan la actividad de la enzi~na, hechos que revelarían que la ~nisnia pertenece al grupo de las cisteinil-proteasas. Muestra Glúcidos Pro teíiias Actividad Actividad (mglmi) -(O/O) (mg/d) (0/0) (Ucas/mi) (O/O) espec-ítica Extracto crudo 2,73 100,O 0, ,O 2, ,O 10,76 Tabla 1. Resultados de la precipitación acetónica fraccionada del ex~racto crudo (ver detalles en el texto).

5 acta farmacéiitica bonaerense - vol. 13 no 1 - año 1994 Figura 1. Efecto del ph sobre la actividad caseinolítica de la enzima parcialmeiite purificada. La misma fue ensayada a distintos valores de ph, medidos en la mezcla de reacción, durante 5 minutos a 37 'C. Cada valor resulta de promediar 5 determinaciones y las experiencias fueron repetidas dos veces. o min Figura 2. Estabilidad térmica de la enzima parcialmente purificada. Las muestras fueron preincubadas las temperaturas indicadas durante tiempos variables, determinando la actividad caseinolítica residual a 37 OC durante 5 minutos. Cada valor resulta de promediar 5 determinaciones y las experiencias fueron repetidas dos veces..-. protelna Número de tubo 0 Figura 3. Cromatografia de intercambio aniónico (DEAE-Sephadex Fast Flow) de la enzima parcialmente purificada (ver detalies en el texto) El perfil de ph de la enzima parcialmente purificada se muestra en la figura 1. Se observan valores superiores al 85% de la actividad máxirila entre ph 8 y 10, aunque a ph fisiológico la actividad es considerablemente elevada (65 a 80% del valor máximo). La estabilidad térmica de esta preparación está representada en la figura 2. La enzima resulta ser bastante termoestable, ya que al cabo de 1 hora a 45 "C mantiene un 70% de la actividad inicial. Por.otra parte, ensayos adicionales han demostrado que tanto el congelainiento como la liofilización no afectan significativamente la actividad enzimática. La figura 3 muestra los resultados obtenidos al someter el liofilizado redisuel-. to del precipitado acetónico a cromatografía de intercambio anió~lico. No existen proteínas con actividad proteolítica de pi superior a 8 y durante la aplicación del gradiente salino eluyen dos fracciones activas cuando la concentración de cloruro de sodio es 0,12 M (Fracción 1) y 0,23 M (Fracción 111, respectivamente.

6 B~iio, A., R.M. Hilal, C.L. Natalucci y N.O. Caffini Número de tubo Figura 4. Cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G-75) de la Fracción 1 (ver detalles en el texto) Figura 5. Cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G-75) de la Fracción 11 (ver detalles en el texto) -1, 660 Figura 6. Electroforesis en gel de poliacriiamida en presencia de dodeciisulfato de sodio (SDS- '-* - PACE) de la enzima parcialmente purificada (b) 45,O y zimograma de la misma (a). Se utilizaron los $rys U 29,O siguientes patrones de peso molecular (Sigma): a-lactalbúmina bovina (14,2 kda), inhibidor de m tripsina de soja (20,l kda), tripsinógeno de pán- 0 24,O creas bovino (24 kda), anhidrasa carbónica de.sc 20,l eritrocitos bovinos (29 kda), gliceraldehido-3- i~r fosfato deshidrogenasa de conejo (36 kda), albúmina de huevo (45 kda) y albúmina bovina a b (66 kda). Al someter la Fracción 1 a cromatografía de exclusión molecular se obtiene una única fracción con actividad enzimática, en tanto que cuando se hace lo propio con la Fracción 11 se advierte la presencia de una fracción principal y de una segunda casi imperceptible, demayor peso molecular (Figuras 4 y 5). La electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) del precipitado acetónico revela la presencia de seis bandas proteicas, de pesos moleculares entre 14 y 67 kda. De ellas sólo tres demuestran poseer actividad caseinolitica, detectable a través de un zimograma: una banda principal de alrededor de 54 kda, una segunda de 30 kda y una banda menor de 27 kda (Figura 6). Agradecinaietrtos. Al Dr. Aníbal G. Amat (Universidad Nacional de Misiones, Argentina), por la recolección y determinación del material estudiado. El presente trabajo ha recibido apoyos del CONI- CET (PID-BID 1119), Comisión de I~~vestigaciones Científicas de la Provincia de Buenos Aires, Facultad de Ciencias Exactas de la Universidad Nacional de La Plata y Departamento Científico del Colegio de Farmacéuticos de la Provincia de Buenos Aires.

7 acta farmacéutica bonaereme - vol. 13 no 1 - año 1994 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Caffini, N.O., L.M.I. López, C.L. Natalucci y N.S. Priolo (1988) Acta Fari?~. Bonaerense 7: Batkin, S., S.J. Taussing y J.Szekerczes (1988) J.Cancer Res. Clin. Oncol. 114: Degema, T.R., S. Swedenberg, S.L. Johnson, M. Madison y D.S. Bradford (1992) J. Bone Joint Sutgery 7IA: Cooreman, W.M., S. Scharpé, J. Demeester y A. Lauwers (1976) Pharnt. Acta Helu. 51: Toro-Goyco, E., A. Maretzki y M. L. Matos (1968) A&. Biochenz. Biophys 126: Toro-Goyco, E., 1. Rodríguez-Costas y H. Ehrig (1980) Biochim. Biophys. Acta 622: Cruz, M.T., M. del C. Oliver, L.M. del Castillo y M. Castañeda-Agulló (1974) Rev. Latinoamer. Quím. 5: Hernández Arana, A., A. Rodríguez Romero, M.T. Cmz y Victoria y L.M. del Castillo (1983) Rev. Latinoamer. Quím. 14: Montes, C., M. Amador, D. Cuevas y F. Córdoba (1990) Agric. Biol. Chem. 54: Caffini, N.O., C.L. Natalucci, N.S. Priolo y M.S. Buttazzoni (1788) Acta Fui-in.Bunueme7: Natalucci, C.L., N.S. Priolo, N.O. Caffini y L.M.I. López (1988) Acta Farm. Boilaererzse 7: Priolo, N.S., L.M.I. López, M.C. Ambére, C.L. Natalucci and N.O. Caffini (1971) Acta Alimentana (Budapest) 20: Priolo, N.S., M.S. Buttazzoni, N.O. Caffini y C.L. Natalucci (1986) Acta Farin. Bonaerense 5: Castellanos, A. (1945) "Bromeliaceae", en "Genera et species plantarum aventinarumn(h.r. Descole, dir.), G. Kraft Ltda., Buenos Aires, Argentina, 111, págs. 137 y Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72: Dubois, M., K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers y F. Smith (1756) Anal.Chenl. 28: Good, N.E. y S. Izawa (1972) Metb.Enzymo1. 24: Laemmli, U.K. (1970) Nature 227: Westergaard, J.L., C. Hackbarth, M.W. Treuhaft y R.C. Roberts (1780) J. Zrzmunol. Meth. 34: López, L.M.I., C.L. Natalucci y N.O. Caffini (1989) Acta Famz. Bonaerense 8:

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