QUIMICO FARMACEUTICO


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1 UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA Facultad de Farmacia y Bioquímica TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE: QUIMICO FARMACEUTICO Actividad Antibacteriana del Extracto Etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) Mediante el Método de difusión en disco (Kirby-Bauer) Presentado Por las Bachilleres: Moisés Armando Donayre García Rosa Marleni Lao Valdivia Asesores: Q.F. Luis Alberto Vílchez Alcalá. Co Asesor: Q.F. Robert Dávila del Castillo. Iquitos Perú 2013

2 Actividad Antibacteriana del Extracto Etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) mediante el Método de difusión en disco (Kirby-Bauer) Moisés Armando DONAYRE GARCÍA 1 Rosa Marleni LAO VALDIVIA 1 1 Bachilleres de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) Resumen: El propósito del presente estudio fue evaluar la actividad antibacteriana del Extracto Etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) mediante el método de difusión en disco (Kirby Bauer). La muestra fue recolectada en la comunidad SAN ANDRES, ubicado en las coordenadas geográficas de latitud sur 3º 41 2, longitud 73º 16 43, y una altura de 92 m.s.n.m. (coordenadas UTM, x 691,155.29, y 9 591,999.76). La muestra se identificó taxonómicamente en el Herbarium Amazonense (AMAZ) de la Facultad de Ciencias Biológicas (FCB) de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP) y fue procesado en el laboratorio de Ingeniería Alimentaria ubicada en la Planta Piloto de la UNAP. La determinación de la Actividad Antimicrobiana mediante el Método de KIRBY-BAUER se realizó en los ambientes del Laboratorio de Microbiología de la FCB de la UNAP. La muestra fue secada por 2 semanas a 60 C; Luego se adiciono etanol al 70 % durante 7 días y se procedió a concentrar por rotavapor. Luego se procedió a la determinación de las características fitoquímica de la muestra en estudio. El rendimiento de las muestras se observa que el tallo presenta mayor rendimiento (8.91 %), mientras que las hojas es la menos abundante (6.83 %). El tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de hojas y tallo de C. surinamense L. (huaca) evidencio abundante presencia de alcaloides, triterpenosesteroides, flavonoides y saponinas, reportándose en pequeñas proporciones principios amargos - astringentes y glicósidos. La mayor inhibición obtenida con el método de Kirby-Bauer se obtuvo con el extracto etanólico de hojas de C. surinamense L. (huaca) alcanzando un mayor diámetro de halo de inhibición en 64 mg/ml con un halo promedio de ± 1.05 mm frente a Staphylococus aureus ATCC 25923; sin embargo comparando con los halos de inhibición de los controles positivos no fue estadísticamente significativo. Todas las cepas gran negativas de Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC presentaron resistencia a las diferentes concentraciones ensayadas (método de Kirby-Bauer) del extractos etanólico de tallo y hojas de Clibadium surinamense L. (huaca). No se realizó la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de hojas y tallo de C. surinamense L. (huaca) debido que no presentaron halos de inhibición significativas en el método de Kirby-Bauer. Se concluye que los extractos etanólico de hojas y tallo de de C. surinamense L. (huaca) no presenta actividad antibacteriana frente a las cepas estudiadas. Palabras claves: Clibadium surinamense L. (Huaca), extracto etanólico, Staphylococus aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Escherichia coli ATCC 25922, halo de inhibición, Concentración Mínima Inhibitoria

3 Actividad Antibacteriana del Extracto Etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) mediante el Método de difusión en disco (Kirby-Bauer) PAGINA DE APROBACIÓN Ing. Cleto Jara Herrera. PRESIDENTE Q.F. Henry Vladimir Delgado Wong. MIEMBRO Dr. Charles Ocampo Falcón. MIEMBRO Memoria presentada por los Bachilleres Moisés Armando Donayre García y Rosa Marleni Lao Valdivia para optar el grado de Químico farmacéutico por la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana Q.F. Luis Alberto Vílchez Alcalá. ASESOR Q.F. Robert Dávila del Castillo. Co ASESOR

4 DEDICATORIA A Dios por sobre todas las cosas Por la Luz, fuerza, alegría que nos da Y derrama sus bendiciones Cada día de nuestras vidas MOISES A. DONAYRE GARCIA Dedico este trabajo con amor a mis padres MOISES DONAYRE MEDINA y GLORIA GARCIA DE DONAYRE, por ser ejemplo de superación y de lucha constante, por ser cómplice de mis sueños y anhelos, por brindarme fortaleza en mis flaquezas para levantarme y continuar adelante en todas mis metas trazadas a mis hermanos en especial a CYNTHIA DONAYRE mi hermana, por quien me esfuerzo para ser cada día mejor; por apoyarme y estar siempre a mi lado en los momento buenos y malos, finalmente a mi flaquita MARIA FE, mi sobrinita querida. ROSA MARLENI LAO VALDIVIA: Esta Tesis se la dedico en primer lugar a Dios quien supo guiarme por el buen camino, darme fuerzas y no desmayar en los problemas que se presentaban, también dedico con amor a mis padres: ENRIQUE LAO TUISIMA y MARLENI VALDIVIA ISUIZA, por darme la vida, por sus consejos, comprensión, amor, ayuda en los momentos difíciles y por ayudarme en los recursos necesarios para ser profesional, a mis hermanitos PAUL LAO y PIERO LAO, a mi esposo JUAN CARLOS por su amor, tiempo y comprensión y a mi hijo DEREK, por ser mi motivación, inspiración y felicidad y por quien me esfuerzo para ser cada día mejor. Y a cada integrante de mi linda y hermosa familia por el apoyo moral y espiritual de cada día.

5 AGRADECIMIENTO El presente trabajo ha sido posible con la ayuda de las personas cuyos esfuerzos favorecieron en la realización de este proyecto de tesis. Una de las preeminencias especiales de que disfrutamos y al mismo tiempo un privilegio, fue trabajar con nuestro asesor y Co-Asesor, cuyos talentos y energía contribuyeron a la realización de la tesis. Al Q.F. Luis Alberto Vilchez Alcalá, de quién tengo el mejor de los recuerdos como docente y como persona. Al Q.F. Robert Davila, por los aportes realizados en el análisis y discusión de los resultados y por el apoyo incondicional en la parte microbiológica del presente estudio. A la Sra. Chachita que nos brindó su apoyo incondicional en lo que es el tramite administrativos para llegar hasta donde hemos llegado. A la Sra. Lency por la voluntad de apoyarnos en tramites finales del presente trabajo. A todas aquellas personas que de una y otra forma colaboraron en la realización de la presente tesis.

6 ÍNDICE DE CONTENIDO.. INTRODUCCIÓN 1 CAPÍTULO I: EL PROBLEMA FORMULACION DEL PROBLEMA OBJETIVOS General Específicos HIPÓTESIS DEFINICIONES OPERACIONALES Variables Variables Independiente Variables Dependiente Indicadores Indicador Independiente Indicador Dependiente Operacionalidad de variables 7

7 CAPÍTULO II: MARCO TEÓRICO ANTECEDENTES BASES TEÓRICAS Clibadium surinamense L. HUACA Clasificación Taxonómica Descripción Botánica Composición Fitoquímica Uso Tradicional Estudios Toxicológicos Distribución Geográfica Método de Susceptibilidad por Disco de Difusión Antecedentes Fundamento del Método Indicaciones y Limitaciones Método Antimicrobianos Seleccionados Control de Calidad Preparación de MacFarland Resultados Método de Dilución en Caldo Antecedentes Fundamento del Método Indicaciones y Limitaciones Método Comparación de Técnicas 35

8 Característica de las cepas en estudio Haemophilus influenzae Escherichia coli Staphylococcus aureus Pseudomona aeruginosa 44 CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODO METODOLOGÍA Lugar de Estudio Tipo de Investigación Diseño de la Investigación Flujograma de Estudio Diagrama de Flujo para Extracción etanólico Diagrama de Flujo del Procedimiento General para la prueba de Susceptibilidad Procedimiento Experimental Recolección y Procesamiento de las Muestras Identificación Taxonómica de la Muestra Vegetal Preparación de Materia Prima Limpieza Lavado Cortado Secado Molienda Obtención del extracto etanólico 52

9 Determinación del Rendimiento Tamizaje Fitoquímico Evaluación de la Actividad Antibacteriana Preparación del Inóculo Preparación de los Discos de Sensibilidad Aplicación de los Discos Determinación de la CMI POBLACIÓN Y MUESTRA Población en Estudio Muestra en Estudio Selección de las Muestras Botánicas Lugar de Muestreo INSTRUMENTOS Material Vegetal Material Biológico en Estudio Medios de Cultivos Materiales de Vidrio Materiales de Plástico Material de Metal Otros Materiales Equipos Reactivos ANÁLISIS DE DATOS PROTECCIÓN DE LOS DERECHOS HUMANOS CUESTIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN 60

10 CAPÍTULO IV: RESULTADOS RESULTADOS Determinación del Screening Fitoquímico Determinación de la Solubilidad de Solventes Orgánicos Resultados de los Diámetros de Halos de Inhibición DISCUSIÓN CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA Referencias Bibliográficas URL`s 95 ANEXOS 97 ANEXO 1.- Datos de pasaporte de colección de especies vegetal en estudio 97 ANEXO 2.- Exicata de Clibadium surinamense L. (huaca) 98 ANEXO 3.- Recolección de las muestras botánicas 99 ANEXO 4.- Pesada y secado de las muestras botánicas colectadas 100 ANEXO 5.- Obtención del extracto etanólico 101 ANEXO 6.- Tamizaje Fitoquímico 102 ANEXO 7.- Técnica de Kirby-Bauer 108 ANEXO 8.- Diámetro del halo de inhibición para Escherichia coli ATCC ANEXO 9.- Diámetro del halo de inhibición para Pseudomona aeruginosa ATCC

11 ANEXO 10.- Diámetro del halo de inhibición para Staphylococcus aureus ATCC ANEXO 11.- Diámetro del halo de inhibición para Haemophilus influenzae ATCC ANEXO 12.- Problemas que pueden surgir en la determinación de los halos de inhibición de las cepas utilizadas como control de calidad 120 ANEXO 13.- Solventes y diluyentes para antimicrobianos 121 ANEXO 14.- Sustancias que interfieren con la Actividad Antimicrobiana 123 GRAFICO 82 GRAFICO 1.- Porcentaje de rendimiento del EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. 62 GRAFICO 2.- Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadium surinamense L. en disco frente a Staphylococcus aureus ATCC GRAFICO 3.- Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadium surinamense L. en disco frente a Haemophilus influenzae ATCC GRAFICO 4.- Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadium surinamense L. en disco frente a Pseudomona aeruginosa ATCC GRAFICO 5.- Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadium surinamense L. en disco frente a Staphylococcus aureus ATCC GRAFICO 6.- Medias e intervalos de Tukey HSD al 95,0 73

12 CUADRO 82 CUADRO 1.- Análisis de varianza (ANOVA) para comparar la actividad antibacteriana del EE de Clibadium surinamense L. a través de la variación de promedios de halo de inhibición frente a Staphylococcus aureus ATCC entre las diferentes concentraciones empleadas 71 CUADRO 2.- Prueba de significación de Tukey para actividad antibacteriana del EE de Clibadium surinamense L. frente a Staphylococcus aureus ATCC por el método de difusión del disco (Kirby Bauer) 72

13 TABLAS 82 TABLA 1.- Características Generales de E. Coli 39 TABLA 2.- Escherichia coli. Patógeno Entérico 41 TABLA 3.- Toxiinfecciones Alimentarias Producidas Por E. Coli Patógeno Entérico 41 TABLA 4.- Screening Fitoquímico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) 61 TABLA 5.- Rendimiento del EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. TABLA 6.- Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a Staphylococcus aureus ATCC TABLA 7.- Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a Haemophilus influenzae ATCC TABLA 8.- Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a Pseudomona aeruginosa ATCC TABLA 9.- Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a Escherichia coli ATCC

14 FIGURA 82 FIGURA 1.- Clibadium surinamense L 12 FIGURA 2.- Kaempferol 13 FIGURA 3.- Quercetina 14 FIGURA 4.- Acetato de cunaniol 14 FIGURA 5.- Éster cáprico de Ictiotereol 15 FIGURA 6.- Éster 7 -en-miristico tetrahidroictiotereol 15 FIGURA 7.- Principio de la técnica de difusión con disco en agar 21 FIGURA 8.- Determinación de la Concentración inhibitoria mínima (CMI) y de la Concentración Bactericida Mínima (CMB) 33 FIGURA 9.- Ejemplo de un análisis de regresión para determinar la relación entre la CIM y los puntos de quiebre en la prueba de difusión con disco 34 FIGURA 10.- Determinación de algunos errores aplicados a la determinación de la Concentración inhibitoria mínima (CIM) 35 FIGURA 11.- Tinciones de Gram de Haemophilus influenzae. 36 FIGURA 12.- Microfotografía de contraste de Escherichia coli 41 FIGURA 13.- Microfotografía de contraste de Staphylococcus aureus 43 FIGURA 14.- Microfotografía electrónica de barrido de Pseudomonas aeruginosa 44 FIGURA 15.- Esquema del diseño de investigación en la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) 47 FIGURA 16.- Fundamento de la determinación de la CMI y CMB 55

15 INTRODUCCIÓN El aumento de microorganismos resistentes a los agentes antimicrobianos es el principal problema al que se enfrenta la ciencia médica en el tratamiento de las enfermedades infecciosas (1), (2); su efecto es mayor en los países en vías de desarrollo (URL1), (3). Esta problemática tiene mayor incidencia en alteraciones orgánicas como tuberculosis, malaria, cólera, neumonías, etc., que en conjunto constituyen la causa de muerte de más de 10 millones de individuos anualmente en el mundo (4), (5). Lo anterior deja ver la necesidad de ampliar el arsenal terapéutico mediante el descubrimiento de moléculas bioactivas novedosas, las cuales pueden ser halladas a partir de fuentes naturales (6), (7). De acuerdo a Bermúdez et al. (2005), la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que más del 80% de la población mundial utiliza la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades de atención primaria de salud y que gran parte de los tratamientos tradicionales se basa en el uso de extractos de plantas o sus principios activos (8). En las últimas décadas, se han realizado innumerables estudios sobre sustancias con actividad antimicrobiana provenientes de plantas superiores con la finalidad de encontrar alternativas terapéuticas efectivas contra las infecciones producidas por microorganismos resistentes a los antibióticos. En tal sentido, se hace necesaria la búsqueda de nuevas fuentes naturales con efecto antimicrobiano (9), (10) Las plantas medicinales han sido consideradas a través de los años como el origen o punto de partida del desarrollo de los medicamentos, ya que han contribuido grandemente al descubrimiento de nuevas sustancias con actividad biológica y a la producción de fitofármacos (11). Es la fuente de medicamentos más económica y de mayor disponibilidad para la mayoría de los países (12), (13). Clibadium surinamense L. (huaca) presenta una extensa aplicación etnobotánica en América Latina como biocida (14-16). Estudios previos han mostrado que dicha especie posee tipos de moléculas como flavonoides, sesquiterpenos y alcaloides de gran interés (17-25), motivo por el cual su estudio se convierte en una actividad promisoria y de interés en el presente trabajo de investigación, cuya finalidad es conocer y demostrar el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de hojas y tallo frente a cepas bacterianas, contribuyendo a que se tenga referencia para futuros proyectos en el campo farmacéutico. 1

16 CAPÍTULO I EL PROBLEMA 1.1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN El Extractos Etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca), tendrán actividad antibacteriana in vitro frente a cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC

17 1.2.- OBJETIVOS General Determinar la actividad antibacteriana in vitro del extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca), frente a cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC25922 mediante el método de disco difusión (Kirby - Bauer) Específicos Recolección de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) Identificar taxonómicamente la muestras de Clibadium surinamense L. (Huaca) Obtención del extractos etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) recolectadas en la comunidad de San Andrés. Realizar el Screening Fitoquímico del extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) Medir los diámetros de los halos de inhibición de las cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de los extractos etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca). 3

18 1.3.- HIPÓTESIS Los extractos etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca), presentan actividad antibacteriana in vitro frente a cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC

19 1.4.- DEFINICION OPERACIONAL Variables Variables Independiente Hojas de Clibadium surinamense L. (Huaca) Extractos Etanólico Tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) Extractos Etanólico Variables Dependiente Actividad Antimicrobiana frente a: Cepa de Staphylococcus aureus ATCC Cepa de Haemophilus influenzae ATCC Cepa de Pseudomona aeruginosa ATCC Cepa de Escherichia coli ATCC

20 Indicadores Indicador Independiente Concentración del extracto etanólico de hojas de Clibadium surinamense L. Tratamiento 1 : 2 mg/ml Tratamiento 2 : 4 mg/ml Tratamiento 3 : 8 mg/ml Tratamiento 4 : 16 mg/ml Tratamiento 5 : 32 mg/ml Tratamiento 5 : 64 mg/ml Concentración del extracto etanólico del tallo de Clibadium surinamense L. Tratamiento 1 : 2 mg/ml Tratamiento 2 : 4 mg/ml Tratamiento 3 : 8 mg/ml Tratamiento 4 : 16 mg/ml Tratamiento 5 : 32 mg/ml Tratamiento 5 : 64 mg/ml Indicador Dependiente Diámetros de los halos de inhibición de los extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC

21 Operacionalidad de variables Variable INDEPENDIENTE DEFINICIÓN DIMENSIÓN INDICADOR Definición operacional Actividad antimicrobiana de Capacidad del extracto Cuantitativa Diámetro de halo de Medido en mm. los extractos etanólico de hojas etanólico de hojas y tallo de inhibición y tallo de Clibadium Clibadium surinamense L. surinamense L. (Huaca) (Huaca) de inhibir el crecimiento microbiano que se desarrolla en un medio dado. 7

22 Variable DEPENDIENTE DEFINICIÓN DIMENSIÓN INDICADOR Definición operacional Las diferentes cepas microbiológicas Especie bacteriana que Cepa de Staphylococcus Crecimiento Turbidez que serán utilizadas en los ensayos de desempeña un papel aureus ATCC bacteriano de la cepa. UFC actividad microbiológica: preponderante en el Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae desarrollo de infecciones locales y sistémicas. Cepa de Haemophilus influenzae ATCC Pseudomona aeruginosa Escherichia coli Cepa de Pseudomona aeruginosa ATCC Cepa de Escherichia coli ATCC

23 CAPÍTULO II MARCO TEÓRICO En la actualidad existe una gran variedad de antibióticos de primera, segunda y hasta tercera generación que ofrecen una amplia variedad de opciones para el tratamiento de padecimientos causados por bacterias (26). Estos antibióticos están perdiendo eficacia por el aumento progresivo de la resistencia microbiana, lo que constituye un problema de primera línea para la salud pública global (27,28). Esto se debe, principalmente al tratamiento farmacológico incompleto de los pacientes, debido a la automedicación, y abandono de los tratamientos respectivos. A esto se suma, el uso irracional de antibióticos que contribuyen a la aparición de cepas microbianas multi-droga-resitentes (29). Este problema, se agudiza cada vez por el elevado costo de los fármacos, lo cual resulta inaccesible para la población de bajo recursos económicos (30). El conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana se debe orientar a la elaboración de esquemas de tratamiento más eficaces, políticas, estrategias, programas y metodologías que proporcionen una adecuada vigilancia en la elaboración y uso racional de antibióticos (31). El conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana se debe orientar a la elaboración de esquemas de tratamiento más eficaces, políticas, estrategias, programas y metodologías que proporcionen una adecuada vigilancia en la elaboración y uso racional de antibióticos (32-35). El Perú, posee una gran biodiversidad en cuanto a flora, siendo alrededor de 300 mil especies vegetales consideradas de uso medicinal y muchas de ellas han sido empleadas por nuestros ancestros en el tratamiento de enfermedades producidas por microorganismos (32, 36-39) pero, en cuanto a estudios farmacológicos y principios activos de las plantas medicinales en la Amazonía peruana aún son escasos, por lo que existe poca información científica que determine la sensibilidad o resistencia a muchos microorganismos. 9

24 2.1.- ANTECEDENTES Siendo una de las pocas especies usada tradicionalmente como ictiotóxico para la pesca artesanal por parte de la población pesquera que vive a expensa de esta actividad (40, 41), la huaca (Clibadium surinamense L.) fue reportada por muchos excursionista investigadores que vieron en nuestros pobladores nativos el uso que le daban a esta especie (42). Pammel et al, (1911), en describe al género Clibadium como plantas venenosas (14). Heizer (1949), clasifica a 6 especies del genero Clibadium dentro de ellas al Clibadium surinamense L., con propiedades ictiotóxicas (16). Ander et al, (2001), incluyo al Clibadium surinamense L., con posibles efecto biocida e ictiotóxico (15). Vásquez et al, (2000) indica que la familia Asteraceae está considerada dentro de las 10 familias con el mayor número de géneros y especies en la flora total y amazónica del Perú, comprende 65 géneros Amazónicos, 124 especies amazónicas, 222 géneros para el Perú, 1432 especies para el Perú y 20 especies endémicas amazónicas (43). 10

25 2.2.- BASES TEÓRICAS Clibadium surinamense L. HUACA Clasificación Taxonómica Según el sistema de clasificación de Adolf Engler, modificado por Hans Melchior (44) en 1964, su clasificación taxonómica es la siguiente: REINO : Plantae SUB REINO : Tracheobionta SUPER DIVISION : Spermatophyta DIVISIÓN : Magnoliophyta CLASE : Magnoliopsida ORDEN : Asterales FAMILIA : ASTERACEAE (alt. COMPOSITAE) GÉNERO : Clibadium Linnaeus ESPECIE : Clibadium surinamense Linnaeus (44, URL2-4) NOMBRE VULGAR : Huaca (45), Barbasco (37, 46, 47) en Perú, Conabim, Cunambi en Brasil (48-50) Descripción Botánica Arbustos o árboles pequeños de 1-3 m de alto, rara vez hierbas, usualmente con el indumento escabroso. Hojas opuestas, márgenes aserrados, ásperas por el haz, suave por el envés. Capítulos heterógamos, inconspicuamente radiados, dispuestos en panículas racemosas o corimbosas; involucros ovoides o subglobosos; filarios biseriados, los exteriores herbáceos a cartáceos, separados, imbricados, con los márgenes herbáceos y enteros, los interiores membranáceos o cartáceos. 11

26 Receptáculos ligeramente convexos, paleáceos cerca de los márgenes, a veces desnudos en sus centros; radios fértiles, con las corolas inconspicuas, tubulares, blancas, con 2-4 lóbulos; flósculos perfectos, pero los ovarios estériles, las corolas con la garganta cilíndrica, blancas; anteras negras; estilo sin ramificaciones. Cipselas obovoides, a veces comprimidas, la superficie exterior convexa, a veces carinada la interior, negras cuando maduras; vilano ausente (40, 50-52, URL-1) (ver anexo Nº 02) Fig. 1. Clibadium surinamense L. 1: Habitad. 2: hojas. 3: Cabeza. 4: Flor macho. 5: Male floret, corolla opened to show androecium. 6: Antenas 7: Female floret. 8: Corolla opened to show style branches. 9: Inflorescencia (53) 12

27 Composición Fitoquímica El género Clibadium presenta flavonoides, sesquiterpenoides, acetilenos y benzofuranos (41, 53, 55); según Schultes (1990), confiere a los benzofuranos su actividad ictiotóxica (46). En estudios fitoquímicos realizados en las hojas de Clibadium surinamense L.; se encontró la presencia de cumarinas, triterpenoides, saponinas, taninos, fenoles, azúcares reductores (18, 41, 46, 55), además de flavonoides (71) Czerson et al, (1979) aisló un nuevo germacrólido de C. surinamense, trans-βbergamoteno (56). Bohm y Stuessy ( ) aisló 3 tipos de flavonoides derivados del kaempferol, quercetina y quercetagetina (17, 18, 54). Mismo resultados obtenidos por Según Correa & Bernal (1990) ver figura 2 y 3 (57). Fig. 2. Kaempferol 3-O-(2,6 -di-o-α-l-ramnopiranosil)- β-d-glucopiranósido 13

28 Fig. 3. Quercetina 3-O-(2,6 -di-o-α-l-ramnopiranosil)-β- D-glucopiranósido Pérez-Amador et al. (1994) caracterizó aceites esenciales de las hojas, raíz e inflorescencia del Clibadium surinamense L. como -pineno, camfeno, limoneno, eucaliptol, citronelal y en pequeñas proporciones mentol, linalol, geraniol, dodecanol (62). También se aisló y caracterizo químicamente compuestos poliacetilénicos de naturaleza isoprénica: Cunaniol (ver figura N 4), de las hojas de Clibadium surinamenses L. (58, 59). Fig. 4. Acetato de cunaniol Mora (1998), aisló un nuevo alcaloide de naturaleza Esteroidal de la especie Clibadium surinamense L. (20). Ese mismo año se deslucida la Acetil- Germacranolida (21). 14

29 En el 2000 se aislaron más alcaloides esteroidales y sesquiterpenoides como el Epoxiclibandiol, un Nuevo Eudesmano-Sesquiterpeno del Clibadium surinamense L. (22-24, 61). Pérez-Amador (2006) identifico mediante espectroscopia por 1H, 13C-NMR, IR, MS y UV, el éster cáprico de ictiotereol, (ver figura N 5) y el 7 -enmiristic éster de tetrahidroictiotereol (ver figura N 6), componentes aislados de la inflorescencia del Clibadium surinamense L. (62). Fig. N 5. Éster cáprico de Ictiotereol Fig. N 6. Éster 7 -en-miristico tetrahidroictiotereol Pérez-Amador MC et al, (2006) menciona que la familia Asterácea contiene compuestos poliacetilenicos y tiofenicos con efecto fototóxicos que actúan como mecanismo de defensas (62) 15

30 Uso Tradicional Conocida vulgarmente como huaca, perteneciente a la familia ASTERACEAE es una planta herbácea, a la cual la medicina tradicional le atribuye propiedades ictiotóxicas (37, 46, 47, 50, 63, 64) y pesticida (URL-5). El Cunambi es usado como tónico y amargo, siendo recomendado para combatir la anemia. Se tiene información de que sus hojas son usadas para curar erisipela y cualquier herida (50). Correa & Bernal (1990) describen que, en Colombia esta especie es empleada como sudorífico y en las enfermedades de los pies y piernas (57). Los indígenas Shuar y Achuar del sur-este del Ecuador lo emplean comúnmente Clibadium surinamense L., bajo el nombre de "barbasco", como ictiotóxico, introduciendo la raíz machacada o la planta entera en el rio o charco; también cogen las hojas e inflorescencias, machacan hasta que libere su pulpa húmeda y lo introducen en el agua agitándolos para una máxima distribución. Los peces al ingerir el sebo se desorienta al cabo de unos minutos pescándoles fácilmente para su consumo (19). Los indígenas de la selva peruana han utilizado la planta por muchos siglos como ictiotóxico. En nuestra Región, las hojas de Huaca son recolectadas y trituradas; para luego ser depositadas a los ríos y ejercer su acción toxica sobre los peces, que se manifiesta mediante una desorientación observada a los pocos minutos (46). La ingestión de hojas de Clibadium surinamensis L. parece ser tóxico que puede llevar a las personas a la muerte (66). Duke & Vásquez, (1994) mencionan que no es toxico para humanos (67). Según Corrêa (1984) el mayor uso de las hojas es triturada, cuyas propiedades se debe a la sabia o sustancia resinosa (50). 16

31 Los indígenas emplean Las hojas maceradas y mescladas con fruto de Bactris gasipes (pijuayo), transformándolas en pequeñas bolas, que son lanzadas al agua para envenenar a los peces que los ingiere (65) Estudios Toxicológicos El Cunaniol (ver figura N 4), es un potente convulsivantes (68), que actúa como un antagonista GABAA receptor (69). Costa et al., (1998) realizó la extracción hexánica de las hojas y tallos de Clibadium surinamense L. y evaluó la actividad convulsivante en ratas pre tratados con diazepam y lamotrigina, los resultados presentaron un aumento en la actividad GABAnérgica con el diazepam, protegiendo la acción convulsivante del extracto hexánico pero una reducción de la liberación de aminoácidos excitatórios producida por la lamotrigina, no inhibió el efecto del mismo, sugiriendo un probable efecto post-sináptico de la huaca (49). Moisés (2002) realizo un estudio con las hojas de Clibadium sylvestre para caracterizar sus efectos convulsivantes utilizado ratas wistar, la cual fueron administrados vía intraperitoneal con dosis de 125 y 500 mg/kg P.C., la dosis efectiva y dosis letal respectivamente. La actividad de la Na + /K + -ATPasa en el hipocampo, "Status epileticus", presento una disminución en todas las fases, recuperando su actividad 24 horas después de la crisis convulsiva. Los resultados indican que el Clibadium sylvestre contiene principios activos que inducen crisis epileptiformes dependiente de la dosis, presentando un potente modelo para estudios de epilepsia experimental (70). Costa et al., (2006). Demostraron que la administración por vía oral en ratones del extracto hexánico (EH) de las hojas de Clibadium surinamense L., induce convulsiones agudas seguido de muerte a los 30 minutos. Los resultados indicaron que el acetato de Cunaniol inhibe la transmisión GABAnérgica, afectando el sistema nervioso y siendo el responsable del efecto convulsivante del C. surinamense L en ratones (59). 17

32 Incháustegui et al., (2002). En estudios toxicológicos realizados mediante el método alternativo toxicológico CTA, luego de administrar vía oral el extracto liofilizado de Clibadium surinamense en ratas albinas cepa holtzman se obtuvo una DL50 de mg/kg, y por el método a dosis límite en ratones albinos cepa Balb-53 por vía intraperitoneal se obtuvo una DL50 de mg/kg (72). Dávila et al., (2009). Realizaron la evaluación mutagénica del extracto acuoso liofilizado (EAL) de Clibadium surinamense L. mediante el test de Ames, utilizaron cepas auxótrofas para histidina de Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 y TA1537. El EAL de las hojas de Clibadium surimanense L. (huaca) dio positivo (mutagénico) a la cepa TA100 +S9 a dosis de 500 y 5000 g/ml (76) Rodríguez et al., (2013). Evaluaron la actividad antimicótica del extracto acuoso liofilizado de las hojas de Clibadium surinamense L. (Huaca) mediante el Método de Microdilución para hongos filamentosos frente a cepas de Trichophyton rubrum ATCC y Trichophyton mentagrophytes ATCC El extracto acuoso liofilizado de las hojas de Clibadium surinamense L. (huaca) presentó actividad antimicótica in vitro frente a los hongos dermatofitos cuya CMI a 72 h, para a T. rubrum fue 0.25 mg/ml. Así mismo, la CMI a 168 h fue de 2 mg/ml y 0.5 mg/ml, mientras que para T. mentagrophytes, la CMI fue 0.5 mg/ml (78). La Universidad de los Andes (2001) realizo estudios de Clibadium surinamense L. el cual menciona que el epifriedenol, campestrol, betasitosterol y estigmasterol son fitoesteroles vegetales que no son bien absorbidos por el tracto gastrointestinal; su acción hipocolesterolémica se limita aparentemente al intestino, en donde se inhibe la absorción del colesterol tanto endógeno como exógeno. Por lo tanto, los fitoesteroles presentes en C. surinamense, podrían estar afectando la síntesis de hormonas esteroideas y de sales biliares que desempeñan funciones importantes dentro del metabolismo energético (URL-6, URL-7). 18

33 Distribución Geográfica El género Clibadium (Asteraceae) comprende 29 especies en América Latina, desde México hasta Perú, con 8 números de especies en Costa Rica, Colombia, y Ecuador (54). Clibadium surinamense es la especie más común de este género (53, URL-8) se distribuye de México a Colombia, Ecuador, Perú y Las Antillas (64), desde América Central hasta Guyana (57, 64). En nuestro país, se encuentran en los departamentos de Loreto, Madre de Dios, San Martín y Pasco (75). 19

34 Método de Susceptibilidad por Disco de Difusión Kirby Bauer Antecedentes El principio de las pruebas de difusión por disco ha sido utilizado por más de 70años en los laboratorios de microbiología. Alexander Fleming utilizó una variante de esta técnica cuando trabajaba con la penicilina en los años cincuenta. En ese tiempo, había tantos procedimientos diferentes en uso como microbiólogos. Los doctores Bauer, Kirby, Sherris y Turck probaron minuciosamente todas las variables involucradas en el proceso, tales como los medios de cultivo, la temperatura y el espesor del agar. En 1966, ellos publicaron su estudio cimero describiendo la prueba que se usa en la actualidad (76). El NCCLS adoptó los pasos básicos de los procedimientos descritos en el estudio de Bauer como el método de referencia para difusión por disco (77-84) Fundamento del Método El antibiograma disco - placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos (79-84). El antibiograma disco - placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas horas de incubación los discos aparecen rodeados por una zona de inhibición. 20

35 Fig. N 7. Principio de la técnica de difusión con disco en agar. La concentración del antibiótico decrece conforma mayor sea la distancia desde el borde del disco (A). En el área en donde la concentración del antibiótico sea insuficiente para inhibir el crecimiento, se observará un margen a partir del cual ocurrirá un crecimiento confluente (B). La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilución (ver figura N 7); Sin embargo, los métodos disco - placa no permiten una lectura directa del valor de la CMI. Para cuantificarla, basta con haber contrastado previamente el sistema disco - placa con un gran número de cepas de CMI conocidas que han estado previamente determinadas por otros métodos de determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos (ej.: método de dilución). Esta determinación se realiza con cientos de bacterias para minimizar errores. Se mide el diámetro de la zona de inhibición obtenida por cada una de tales cepas y se grafica dicha medida frente a la CMI, obteniéndose la línea de regresión o "recta de concordancia" que proporciona la correspondencia entre las CMI y los diámetros de inhibición. Para determinar la CMI de una cepa se procede a medir el diámetro de la zona de inhibición y luego extrapolarlo en el gráfico para obtener la CMI. Existen, por tanto, unos diámetros de inhibición, expresados en mm, estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura de los halos de inhibición debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o resistente (R) según las categorías establecidas por el NCCLS (ver anexo N 8-11). 21

36 Indicaciones y Limitaciones El antibiograma está indicado cuando se aísla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos más habituales. Estas pruebas de sensibilidad también son útiles en estudios epidemiológicos ya que el resultado del antibiograma puede ser considerado como el primer marcador epidemiológico de que se dispone. El método de disco-placa es fácil de realizar, rápido y barato. Es una metodología aplicable a una amplia variedad de bacterias, fundamentalmente bacterias aerobias no exigentes de crecimiento rápido como Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Acinetobacter spp., Staphylococcus spp. y Enterococcus spp. Además, con ligeras modificaciones, puede ser aplicado a Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus spp Método A.- Preparación del inóculo. A partir de una placa de cultivo de 18 a 24 horas coger varias colonias con un asa y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al 0.5 de la escala de MacFarland 0.5 en suero fisiológico. Agitar en un agitador "vortex" durante segundos. Este método es el más adecuado para microorganismos de crecimiento difícil en medios líquidos (Haemophilus spp., N. gonorrhoeae, S. pneumoniae, estreptococos no enterococos, Listeria, Moraxella y Corynebacterium spp.) y para estafilococos en los que se quiera detectar la resistencia a oxacilina. 22

37 B.- Inoculación de las placas. Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inóculo, introducir un escobillón dentro de la suspensión y al retirarlo rotar varias veces contra la pared del tubo por encima del nivel del líquido con la finalidad de eliminar el exceso de inóculo. Inocular las placas de Mueller-Hinton completamente, sin dejar ninguna zona libre. Esto se consigue deslizando el escobillón por la superficie del agar tres veces, rotando la placa unos 60º cada vez y pasándola por último por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme. Dejar secar de 3 a 5 minutos antes de depositar los discos. C.- Dispensación de los discos. Colocar los discos manualmente con pinzas estériles. Debe asegurase que contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo que deben presionarse ligeramente sobre la superficie del agar. No deben situarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y han de estar distribuidos de forma que no se produzca superposición de los halos de inhibición. Para placas de 150 mm no se emplearán más de 12 discos y para las de 100 mm no más de 6. Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores a 5 placas, a 35 C en atmósfera aeróbica antes de que transcurran 15 minutos. Las placas se incubarán horas. D.- Lectura de los Resultados. Después de 18 horas de incubación leer el diámetro de las zonas de completa inhibición con un pie de rey o regla. Las zonas de los medios transparentes se miden sobre el reverso de la placa y los medios que contienen sangre sobre la superficie del agar. Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibición, puede tratarse de mutantes resistentes, contaminaciones, poblaciones heterogéneas o cultivos mixtos y conviene volver a identificarlas y realizar otra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana. 23

38 Como regla general, no debe considerarse aquellas colonias diminutas que aparecen en el halo de inhibición y que han sido visualizadas mediante luz transmitida o con ayuda de una lupa, a excepción de estafilococos resistentes a oxacilina o enterococos resistentes a vancomicina. La interpretación de los resultados puede realizarse en función de las normas del NCCLS (79-84) (ver anexo N 8-11) Antimicrobianos Seleccionados Es evidente la imposibilidad de ensayar un gran número de antimicrobianos frente a un microorganismo determinado. La selección final de qué antibióticos deben ser estudiados dependerá del criterio del investigador (86). En las Tablas 1 a 5 (ver en anexo 13 y 14) se muestran los antimicrobianos recomendados por la NCCLS (79-84), agrupados en cuatro grupos según el trabajo de Washington (85). En el grupo A se encuentran aquellos antimicrobianos que se han de ensayar y que deben ser informados de forma rutinaria. El grupo B está constituido por antimicrobianos que pueden ser valorados de forma rutinaria, pero cuya información se efectuará de forma selectiva; es decir, solamente se informarán si los del grupo A no son activos, no son apropiados para un lugar determinado de la infección, o si se constata un fallo terapéutico con el grupo A. En el grupo C están incluidos los antibióticos que serán estudiados cuando aparezcan problemas específicos de resistencia, por ejemplo, brotes epidémicos, en pacientes con alergia a otros antibióticos o en infecciones inusuales. Finalmente, el grupo D, se destina a antimicrobianos utilizados en infecciones del tracto urinario Control de Calidad Es necesario emplear cepas control para supervisar la exactitud y fiabilidad de la metodología, debido también al gran número de variables que pueden afectar los resultados y que se han descrito anteriormente. Las cepas que se utilizan para el control de calidad son las mencionadas en anexo

39 El NCCLS ha establecido unos límites en los diámetros de las zonas de inhibición que son aceptables para las cepas utilizadas en el control de calidad (79-84). Los problemas que podamos encontrar en la determinación del halo de inhibición de las cepas de control de calidad y su resolución se detallan anexo 12. Para el control del inoculo se utiliza un MacFarland Preparación de MacFarland 0.5 Para prepararlo se emplea 0.5 ml de M de BaCl2 (1,175 % BaCl2 + 2H2O) en 99,5 ml de 0.18 M H2SO4 (1% v/v) con agitación constante. La absorción a 625 nm ha de estar entre 0.08 y 0.10 (comprobar cada mes). Alícuotas de 4 a 6 ml se distribuyen en tubos con tapón de rosca y se guardan en la oscuridad a temperatura ambiente Resultados Interpretación: Comparando los diámetros del halo de inhibición con las CMIs, y estableciendo las correspondientes rectas de regresión, se han fijado unos criterios para clasificar las cepas estudiadas. De esta forma se han fijado tres categorías: sensible (S), intermedia (I) y resistentes (R). Anteriormente se añadía la categoría moderadamente sensible (MS) que tiende a eliminarse y los resultados correspondientes a la misma se han situado en la categoría de intermedia. Las interpretaciones seguirán las normas establecidas por el NCCLS (79-84) (anexo 8-14) pero, por regla general, un diámetro de inhibición de 30 a 35 mm es indicativo de una cepa altamente sensible, mientras que diámetros de zona de inhibición inferiores a 15 mm son los que presentan las cepas resistentes. El término sensible indica que la infección ocasionada por la cepa para la que se ha determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibición puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en función del tipo de infección y de la especie considerada. 25

40 El término intermedio indica que el halo de inhibición traducido en valores de CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (p. ej. orina) o cuando se emplean dosis más elevadas de lo habitual. El NCCLS también incluye en esta categoría aquellos casos de antimicrobianos con márgenes de toxicidad estrechos en los que pequeños errores técnicos podrían suponer cambios de interpretación en la categoría clínica (79-84, 86). Finalmente, el término resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de resistencias específicos para el agente estudiado en los que no ha habido una adecuada respuesta clínica cuando se ha usado como tratamiento el correspondiente antimicrobiano (87, 88). 26

41 Método de Dilución en Caldo Antecedentes Las pruebas de dilución han sido utilizadas durante años. Los procedimientos iniciales eran realizados en tubos de ensayo grandes (13 por 100 mm) con volúmenes de caldo de por lo menos 1 ml. Este método fue estandarizado en la década de los años 70 por el Estudio Cooperativo Internacional y luego la NCCLS publicó un estándar del método (31,79-84, 86). Este método es llamado macrodilución en caldo. A partir de los años 60 se comenzaron a utilizar dispositivos serológicos para dispensar y diluir. Esta miniaturización simple de la técnica se conoció como microdilución en caldo Fundamento del Método La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente mediante alguna de las variantes de los métodos de dilución. Estos métodos se basan en la determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o agar). Las primeras determinaciones se realizaron empleando baterías de tubos con caldo de cultivo con un rango determinado de antimicrobiano (macrodilución). Tradicionalmente estos métodos se han venido usando para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y la concentración mínima bactericida (CMB) de los antimicrobianos (89). En la mayoría de los casos se preparan diluciones del antimicrobiano en progresión geométrica en base 2 utilizando un medio de cultivo adecuado; posteriormente se inocula dicho medio y tras la correspondiente incubación para permitir el crecimiento del microorganismo se realiza la lectura, determinando qué concentración causa la inhibición del crecimiento del microorganismo. Si se realiza un subcultivo en medio sin antimicrobiano de los medios sembrados previamente puede determinarse también la actividad bactericida. 27

42 Indicaciones y Limitaciones Los métodos de dilución se consideran de referencia para la determinación cuantitativa de la actividad de los antimicrobianos. Son los métodos indicados cuando, además de la actividad inhibitoria, se quiere determinar también la actividad bactericida. La gran cantidad de variables (dependientes del microorganismo, del medio de cultivo, del inóculo) que influyen en estos métodos son responsables de oscilaciones en el resultado finalmente obtenido, por lo que para su correcta evaluación es necesario que se realicen de forma estandarizada. La determinación de la actividad antimicrobiana mediante técnicas de dilución se realiza utilizando una escala discontinua (habitualmente concentraciones crecientes en base 2) en vez de una escala continua (como sucede en el método de difusión), por lo que los valores de CMI reales de un determinado antimicrobiano se encontrarán en algún valor situado entre la CMI experimentalmente obtenida y la concentración inmediatamente inferior (79-84). Desde el punto de vista clínico la diferencia entre los valores real y experimental de CMI no suelen ser trascendentes cuando se trata de concentraciones bajas, pero pueden tener importancia para las CMIs altas que se acerquen a las concentraciones alcanzables in vivo (84, 89) Método A.- Preparación del Antimicrobiano. Los antimicrobianos a usar en las técnicas de dilución pueden obtenerse de los correspondientes fabricantes, o comprarse directamente a ciertas compañías comerciales. Para los estudios in vitro no es adecuado utilizar las preparaciones de uso clínico, sino que deben emplearse sustancias valoradas de las que se conozcan la potencia (mg de sustancia pura por cada mg de sustancia valorada), la fecha de caducidad y el lote de preparación (76, 77). 28

43 La sustancia valorada debe pesarse en una balanza de precisión. Para conseguir una determinada concentración, lo más sencillo es pesar con un ligero exceso una cantidad de sustancia valorada y, posteriormente, añadir el volumen de diluyente necesario. Como resulta obvio, para calcular una determinada concentración de antimicrobiano hemos de considerar la pureza de la sustancia que se esté empleando (que en la mayoría de casos no es del 100%). Las concentraciones de antimicrobianos deben prepararse al menos 10 veces más concentradas que la concentración más alta que se vaya a evaluar, y en todo caso superior a 1000 mg/l. En el anexo 13 se indican los diluyentes y solventes necesarios para la preparación de los antimicrobianos más habituales. No es necesario esterilizar las soluciones de antimicrobianos porque la contaminación de estas soluciones es muy infrecuente. Las soluciones de antimicrobianos se deben emplear el mismo día de su preparación. Alternativamente, se pueden congelar en alícuotas (usando tubos estériles de vidrio o plástico). La temperatura ideal para la conservación de estas soluciones es de al menos -60ºC, y en todo caso nunca superior a los - 20ºC. Se acepta que a temperaturas de -60ºC las soluciones madres de antimicrobianos son estables, con muy contadas excepciones, durante al menos 6 meses. El número de antimicrobianos a evaluar dependerá de las directrices de cada laboratorio y/o investigador (86). Debe recordarse que el antibiograma además de ofrecer información de interés clínico puede también tener interés epidemiológico y para la identificación de microorganismos, por lo que puede considerarse necesario incluir antimicrobianos que no se utilizan habitualmente en clínica. 29

44 En anexo 12 están los rangos de dilución aconsejables desde un punto de vista clínico (90). Algunos investigadores y/o laboratorios han de estudiar la actividad de nuevos antimicrobianos o realizar estudios comparativos sobre miembros de grupos/familias estrechamente relacionados, pero en general, y teniendo en cuenta que el número de antimicrobianos (de uso clínico) es enorme, no todos ellos se pueden estudiar de forma rutinaria (89). En general, se escoge un representante de un grupo y se asume que la actividad de otros antimicrobianos del mismo grupo, con igual mecanismo de acción y frente a los que los mecanismos de resistencia bacteriana son similares, tendrá una actividad igual o muy similar. Por otro lado, aun cuando el laboratorio estudie un amplio grupo de antimicrobianos de forma rutinaria, muchos autores consideran innecesario informar de todos ellos al clínico. B.- Dilución en Caldo. El NCCLS recomienda para la mayoría de los microorganismos utilizar caldo Mueller-Hinton, al que se añadirán los suplementos necesarios para asegurar el crecimiento de organismos exigentes (79-84). El medio debe tener un ph de 7.2 a 7.4 y estar ajustado con Ca 2+ (20-25 mg/l) y Mg 2+ ( mg/l). Esta cantidad de iones divalentes asegura la reproducibilidad de los valores de CMI de aminoglucósidos frente a P. aeruginosa y de tetraciclinas frente a la gran mayoría de microorganismos, al compararlos con los que se obtienen con agar Mueller-Hinton. El ajuste de cationes del caldo Mueller-Hinton se hará en función de la cantidad basal que contenga el mismo, habitualmente proporcionada por los fabricantes del medio. Por cada 1 mg/l de incremento que sea necesario ajustar se añaden, al medio ya estéril y a 4ºC, 0.1ml de una solución esterilizada por filtración que contiene 10mg de Mg 2+ /ml (8.26 gramos de Cl2Mg.6H20 en 100 ml de agua desionizada) y 0.1ml de solución estéril de 10 mg de Ca 2+ /ml (3.68 g de Cl2Ca.2H2O en 100 ml de agua desionizada). 30

45 Si el fabricante ofrece ya un medio con las cantidades suficientes de cationes divalentes no es necesario ajuste alguno. Existen dos modalidades de los métodos de dilución, en las que se utilizan tubos (macrométodo) o placas de microtitulación (micrométodo). Método de Macrodilución: En el método de macrodilución se emplea por cada combinación microorganismo/antimicrobiano una batería de tubos. Habitualmente se prepara la batería de tubos con 1ml de medio estéril sin antimicrobiano. Al primero de ellos se añade 1 ml de la solución inicial del tubo de antimicrobiano hasta conseguir la concentración más alta a estudiar (teniendo en cuenta que este primer paso supone la dilución a la mitad de la solución madre, y que una vez inoculados los tubos, con 1 ml de inóculo, se diluirá nuevamente la concentración de antimicrobiano a la mitad). Tras mezclar adecuadamente, se pasa 1 ml al siguiente tubo; el proceso se repite tantas veces como diluciones se quieran estudiar, eliminando del último tubo de la serie 1 ml de medio con antimicrobiano, con objeto de mantener el volumen final de 1 ml. Para cada paso de dilución se debe emplear una pipeta diferente. La serie de tubos se completa con uno de control sin antimicrobiano que solamente tiene 1 ml de caldo. Método de Microdilución: En el método de microdilución cada una de los pocillos de la placa de microtitulación con pocillos de fondo en "U" representa uno de los tubos del método de macrodilución. Las placas de microdilución con diferentes concentraciones de antimicrobianos se pueden preparar en el propio laboratorio o bien se pueden comprar a diferentes compañías que los suministran congelados, deshidratados o liofilizados. 31

46 Teniendo en cuenta que la mayoría de placas disponibles tienen 96 pocillos (12x8), podemos estudiar con cada una de ellas, y para el mismo microorganismo 8 antimicrobianos y 11 diluciones (la última columna se suele utilizar como control de crecimiento) o viceversa. En ocasiones se preparan placas con 12 diluciones de antimicrobiano y se utiliza una placa adicional para realizar los controles. El volumen final de cada pocillo es habitualmente de 100 µl, por lo que antes de la inoculación de la placa, cada pocillo debe contener 100 µl de caldo con antimicrobiano (volumen de inóculo menor de 10 µl) o 50 µl (si se van a usar también 50 µl para inocular la placa). En este último caso debe tenerse en cuenta, a la hora de calcular la concentración inicial más alta, que tras añadir el inóculo la concentración de antimicrobiano se diluirá a la mitad. Dependiendo, pues, del volumen de inóculo final, las placas se rellenan utilizando una pipeta multicanal con 100 ó 200µl de la solución más alta de antimicrobiano en la columna 1. Posteriormente se añade un volumen de 50 o 100µl de caldo sin antimicrobiano en los pocillos de las columnas 2 a 11 y se realiza la dilución en la forma habitual empleando la pipeta multicanal, dejando los pocillos de la última columna como controles (positivos - no antimicrobiano- y negativos - no inóculo-). Tras la incubación se procede a la lectura de los resultados. La CMI se define como la menor concentración de antimicrobiano que a simple vista inhibe completamente (o el 80% en el caso de las sulfamidas) el crecimiento del microorganismo estudiado. La interpretación de los resultados, que a veces resulta compleja, se facilita tomando como referencia el crecimiento observado en los tubos o pocillos usados como control positivo. En el caso de las placas de microdilución dichos controles positivos deben presentar una clara turbidez o un botón de al menos 2 mm de diámetro. Para observar el crecimiento de los pocillos, a veces resulta necesario limpiar la parte inferior de la placa de microtitulación, lo que puede realizarse con papel absorbente. La lectura es más sencilla utilizando un lector con espejo en el que se refleja la parte inferior de la placa de microtitulación. En general, los valores de CMI obtenidos mediante microdilución son iguales o una dilución menor a los que se obtienen por macrodilución. 32

47 Fig. N 8. Determinación de la Concentración inhibitoria mínima (CIM) y de la Concentración Bactericida Mínima (CBM). Fundamentos: consiste en exponer a las cepas a estudiar a diferentes concentraciones de antimicrobianos, en diluciones a la mitad y observar el crecimiento de los microorganismos para luego definir la CIM C.- Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) La Concentración Mínima Inhibitoria de un agente antimicrobiano es aquella que inhibe la multiplicación y producción de un crecimiento visible en una cepa bacteriana dada en el sistema de prueba. Se determina incubando una cantidad conocida de bacterias en presencia de diluciones definidas del agente antimicrobiano, posteriormente se hacen los conteos correspondientes para determinarla. Ésta es probablemente la prueba de determinación de CMI más popular. Utilizando los criterios del NCCLS, los resultados son interpretados como microorganismo sensible (tratable), intermedio o resistente (intratable) (79-84). 33

48 D.- Lectura e Interpretación de la CMI. La CIM corresponde a la mínima concentración de antibiótico en donde no se observa desarrollo (turbidez). La CIM se expresa en μg/ml. Luego se debe recurrir, teniendo en cuenta el valor de CIM obtenido para esa cepa, a las tablas para definir según los valores de CIM que en ellas aparecen si las cepas en estudio son sensibles o resistentes a un determinado antibiótico (84). Diámetro de la zona de inhibición (mm) Fig. N 9. Ejemplo de un análisis de regresión para determinar la relación entre la CIM y los puntos de quiebre en la prueba de difusión con disco. En este caso, zonas de inhibición de 20 mm se interpretan como susceptible con una MIC de 8 μg/ml, mientras que zonas de inhibición de 11 mm se interpretan como resistente con una MIC de 32 μg/ml. Zonas de inhibición de mm se interpretan como intermedio con una MIC de 16 μg/ml. 34

49 E.- Informe de Resultados. Cuando la determinación de la CMI tiene una finalidad clínica, no es aconsejable presentar simplemente los valores absolutos obtenidos con cualquiera de los métodos expuestos. Resulta más útil traducir, mediante una categorización cualitativa, estos valores de CMI. La interpretación de estos resultados debe considerar también aspectos farmacocinéticos, posibles mecanismos de resistencia y datos de eficacia clínica. De esta forma se pueden distinguir tres categorías clínicas: sensible, intermedio y resistente (76-91) Comparación de Técnicas Normalmente, las pruebas cuantitativas clásicas (dilución en caldo o en agar) se suelen tomar como patrones de referencia para evaluar otros sistemas de determinación de sensibilidad antimicrobiana. Cualquier laboratorio que realice antibiogramas con regularidad debería comparar periódicamente sus resultados con la determinación de CMI como método de control de calidad. A partir de esta comparación podemos elaborar un cuadro similar al siguiente, en el que se puede ver la clasificación de resultados en las dos técnicas: Fig. N 10. Determinación de algunos errores aplicados a la determinación de la Concentración inhibitoria mínima (CIM). Se consideran errores graves clasificar una cepa resistente como sensible (A) o una cepa sensible como resistente (B); mientras que se consideran errores menores la clasificación de resistentes o sensibles como intermedias (C). 35

50 Característica de las cepas en estudio Haemophilus influenzae Los microorganismos de Haemophilus son bacilos gramnegativos pequeños y, en ocasiones, pleomorfos (ver figura N 11; cuadro 35-1). Haemophilus influenzae es la especie que se asocia con mayor frecuencia a enfermedad y las infecciones en pacientes pediátricos eran las más frecuentes con anterioridad a la introducción de la vacuna frente a H. influenzae tipo b (HIB). Haemophilus aegyptius es una causa importante de conjuntivitis aguda purulenta (92, 93, 95). Desde el punto de vista taxonómico, H. aegyptius pertenece a la especie H influenzae, aunque tradicionalmente se ha separado de esta. Para complicar aún más esta clasificación, H. influenzae biogrupo aegyptius presenta una relación fenotípica con H. aegyptius, si bien difiere de esta especie a nivel taxonómico. El biogrupo aegyptius es el agente etiológico de la enfermedad pediátrica fulminante conocida como fiebre purpúrica brasileña (96). Figura N 11. Tinciones de Gram de Haemophilus influenzae. A Pequeños cocobacilos observados en el esputo de un paciente aquejado de neumonía. 36

51 La estructura de la pared celular de Haemophilus es la típica de otros bacilos gramnegativos. La pared celular posee un lipopolisacárido con actividad de endotoxina, y la membrana externa presenta proteínas específicas de cepa y específicas de especie. El análisis de estas proteínas específicas de cepa resulta de utilidad en los estudios epidemiológicos. La superficie de muchas de las cepas de H. influenzae está recubierta de una cápsula de polisacárido, y se han identificado seis serotipos antigénicos (de la a a la f). Con anterioridad a la introducción de la vacuna HIB, el serotipo b de H. influenzae era el responsable de más del 95% de las infecciones invasivas por Haemophilus. Casi todas las enfermedades causadas por este serotipo han desaparecido tras la introducción de esta vacuna. En la actualidad, los serotipos c y f y los serotipos no encapsulados de H. influenzae producen la mayor parte de las infecciones por H. influenzae. Las especies de Haemophilus se encuentran presentes en casi todas las personas, en las que colonizan principalmente las membranas mucosas del tracto respiratorio (92, 97). La epidemiología de la enfermedad por Haemophilus se ha modificado drásticamente. Antes de la introducción de las vacunas conjugadas frente a H. influenzae tipo b, se estimaba que cada año ocurrían alrededor de casos anuales de enfermedad invasiva por este patógeno en niños menores de 5 años. Las primeras vacunas polisacarídicas frente a H influenzae tipo b no conferían protección a los niños menores de 18 meses (la población con mayor riesgo de enfermedad), dado que existe un retraso natural en la maduración de la respuesta inmune a los antígenos polisacarídicos. No obstante, se comprobó que las vacunas que contenían antígenos PRP purificados conjugados con una molécula transportadora de proteínas (p. ej., toxoide diftérico, toxoide tetánico, proteína de la membrana externa del meningococo) daban lugar a una respuesta humoral protectora en niños de 2 o más meses de edad. Desde la introducción de la vacuna conjugada en diciembre de 1987, prácticamente ha desaparecido la enfermedad sistémica en pacientes menores de 5 años en EE.UU.; tan sólo se describieron 32 casos en el año 2003 (98). 37

52 La mayoría de las infecciones por H. influenzae tipo b se producen actualmente en niños que no son inmunes (como consecuencia de una vacunación incompleta o una respuesta deficiente a la vacuna) y en ancianos con una disminución de la inmunidad. Asimismo, la enfermedad invasiva causada por otros serotipos encapsulados o cepas no encapsuladas de H. influenzae se ha tornado proporcionalmente más frecuente que la originada por el serotipo b. Se debe tener en cuenta que el éxito de la eliminación de la enfermedad por H. influenzae tipo b en EE.UU. no se ha disfrutado en numerosos países en vías de desarrollo en los que las campañas de vacunación no se han llevado a cabo de forma satisfactoria. Por consiguiente, H, influenzae tipo b continúa representando el principal patógeno pediátrico en muchos países. Se estima que cada año se registran 3 millones de casos de enfermedad grave y hasta muertes en niños a nivel mundial. La epidemiología de la enfermedad causada por H. influenzae no encapsulado y otras especies del género Haemophilus es diferente (96, 99) Escherichia coli El género Escherichia se compone de cinco especies, de las que E. coli es la más frecuente y la más relevante desde el punto de vista clínico. Este microorganismo se asocia a una gran variedad de enfermedades, como septicemia, TAU, meningitis y gastroenteritis. E. coli es una de las especies bacterianas más minuciosamente estudiadas, y no solamente por sus capacidades patogénicas, sino también como sustrato y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa índole (102). Forma parte de la familia Enterobacteriaceae (103). Ella está integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, móviles con flagelos peritricos o inmóviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a nitritos, y poseedores de una proporción G+C de 39 a 59% en su DNA. Se trata de bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales. 38

53 Escherichia coli es la especie tipo del género Escherichia. Incluye gérmenes generalmente móviles, que producen ácido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros azúcares. Producen reacción positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son inhibidos por KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como única fuente de carbono y energía, pero sí en caldo acetato. Son H2S, ureasa y fenilalanina negativos, pero en general son indol positivos y decarboxilan la lisina (ver Tabla 1). Se clasifican en más de 170 serogrupos O según las características antigénicas de su LPS, y en serotipos por la combinación de antígenos O y H flagelares. Otros antígenos presentes en distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su clasificación o identificación. TABLA N 1 Características Generales de E. Coli (+) = amplia mayoría de cepas positivas 39

54 E. coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del niño, y establece con el huésped una relación estable de mutuo beneficio (102). Como integrante de la flora normal del hombre y de muchos animales, se lo considera un germen indicador de contaminación fecal cuando está presente en el ambiente, agua y alimentos, junto con otros similares agrupados bajo la denominación de "bacterias coliformes". Estas son enterobacterias que pertenecen al género Escherichia y a otros relacionados como Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter o Serratia, y que tienen en común la capacidad de fermentar la lactosa en un lapso no mayor de 48 horas, con producción de ácido y gas. Son gérmenes de gran ubicuidad y capacidad de proliferación, y a la vez de fácil cultivo e identificación, y por lo tanto muy útiles como indicadores de contaminación, pero no son enteropatógenos como grupo (como tampoco lo es E. coli), y por lo tanto su presencia en alimentos, ambiente o pacientes no certifica la etiología de una infección intestinal o un brote de ETA. E. coli puede ser causa de enfermedad endógena en pacientes debilitados o en situación de alteración de la pared intestinal (peritonitis, sepsis, etc.), pero las infecciones entéricas provocadas por este germen no son causadas por las cepas que habitan normalmente el intestino, sino por líneas especialmente patógenas en esta localización (103) (ver Tabla 2), que se transmiten por vía fecal - oral de persona a persona o a través del agua y alimentos, y que pasaremos a describir. Las características de las afecciones que producen se presentan comparativamente en la Tabla 3. 40

55 Figura N 12. Microfotografía de contraste de Escherichia coli (103) TABLA 2 Escherichia coli. Patógeno Entérico Enterotoxigénicos Enteropatógenos clásicos Entero invasores Productores de toxina de shiga STX Entero agregativos ETEC EPEC EIEC STEC EAEC TABLA 3 TOXIINFECCIONES ALIMENTARIAS PRODUCIDAS Por E. Coli Patógeno Entérico 41

56 Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva esférica que se agrupa en pares, cadenas cortas o agrupado en racimos. Algunas cepas son capaces de producir toxinas termostables capaces de causar enfermedades en humanos como la estafiloenterotoxicosis. La estafiloenterotoxicosis, estafiloenterotoxemia o intoxicación estafilococica es una intoxicación alimentaria asociada a Staphylococcus aureus (104). La gravedad de los síntomas depende de la susceptibilidad del individuo hacia la toxina, la cantidad ingerida de alimento contaminado, la cantidad ingerida de toxina y la salud general en general del hospedero. Los síntomas más comunes son náusea, vómito, dolor y calambres abdominales y postración. Algunos individuos podrían no siempre mostrar todos los síntomas asociados con la enfermedad (105). En los casos más graves podrían presentarse dolores de cabeza, calambres musculares y cambios temporales en la presión arterial y en la frecuencia del pulso. La recuperación generalmente lleva dos días. Sin embargo, no es inusual que la recuperación completa lleve tres días y algunas veces más en los casos más graves (URL-9). Esta intoxicación está asociada a alimentos que se han sometido a un proceso de cocción inadecuado o bien a un almacenamiento a bajas temperaturas (7.2 C o menos) (URL-9). S. aureus es el agente más identificado como causante de enfermedades nosocomiales y es causante de la muerte de ancianos, infantes y personas inmunocomprometidas o muy débiles en casos de enterotoxicosis (URL-9). 42

57 Figura Nº 13. Microfotografía de contraste de Staphylococcus aureus (106) S. aureus se encuentra en el aire, el suelo, el sistema de drenaje, agua, leche y comida o maquinas preparadoras de productos alimenticios, mascotas y humanos. Estos dos últimos son los reservorios principales pues el microorganismo se encuentra en pasajes nasales y garganta, el pelo y la piel de casi el 50% de los individuos aparentemente sanos. La incidencia se incrementa ante los individuos que se encuentren en contacto con personas propensas a la adquisición del microorganismo (107, URL-9). 43

58 Pseudomona aeruginosa Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo ambiental común resistente a algunos desinfectantes químicos, y que además puede crecer en algunos de ellos. P. aeruginosa es el principal agente biológico de la mayoría de las intoxicaciones, septicemias y enfermedades gastrointestinales intrahospitalarias (96). Asimismo, los miembros de la familia Pseudomoniaceae son relevantes en los procesos de conservación de alimentos y constituyen puntos de riesgo en programas de calidad de acuerdo con HACCP (Hazard Analysis of Critical Control Points) (108). Figura Nº 14. Microfotografía electrónica de barrido de Pseudomonas aeruginosa (94). Pseudomonas aeruginosa es una bacteria patógena Gram negativa de 2-5 m de largo por 1 m de ancho, móvil por un flagelo polar. Versátil y oportunista en términos de su genética, potencial metabólico y mecanismos de virulencia (ver fig. 14) (99), ubicuo en la naturaleza e inocuo en casi todos los ambientes, sin embargo, P. aeruginosa puede causar infecciones graves o hasta mortales en pacientes inmunodeprimidos (110). 44

59 Esta versatilidad le da oportunidad de responder a condiciones ambientales variables y frecuentemente adversas. Considerado por muchos como un organismo aeróbico, es capaz de crecer anaeróbicamente en presencia de ciertos sustratos como los nitratos o la arginina (99). Es capaz de crecer en fuentes nutritivas muy simples e inclusive utilizar lentamente compuestos empleados en la formulación de desinfectantes y antisépticos. Se considera mesofílica, aunque puede crecer a 42 C. P. aeruginosa se considera de fácil crecimiento, por lo que puede ser recuperada en medios simples, ricos y selectivos. Asimismo, la patogenicidad del microorganismo se asocia a algunos factores de virulencia que lo hace particularmente hábil para infectar tejidos de hospederos específicos. Entre los principales están: toxinas extracelulares, proteasas, hemolisinas y exopolisacáridos por mencionar algunos (94, ) 45

60 CAPÍTULO III MATERIALES Y MÉTODO METODOLOGÍA Lugar de Estudio El trabajo Farmacognóstico se realizó en el Laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) ubicado en la Av. Freyre N Iquitos. La determinación de la Actividad Antimicrobiana mediante el Método de KIRBY-BAUER se realizó en los ambientes del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológica de la UNAP entre los meses de febrero y Junio del Tipo de Investigación Se empleó el siguiente tipo de investigación: Experimental, porque se evaluó un fenómeno dado introduciendo elementos que modifica el comportamiento de las variables en estudio, las mismas que fueron medidos en determinados momentos. Descriptivo: porque el estudio describió e interpretó en forma clara y detallada los hechos obtenidos en la investigación. Prospectivo, porque se desarrolló hacia delante del tiempo. Longitudinal, porque permitió realizar la recolección sistemática de las variables involucradas en función del tiempo. 46

61 Diseño de la Investigación Figura N 15. Esquema del diseño de investigación en la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) 47

62 Flujograma de Estudio Diagrama de Flujo para Extracción Etanólico Recolección de Muestras Identificación Taxonómica Preparación del extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. Determinación del Rendimiento Obtención del Extracto Etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) Screening Fitoquímico Evaluación actividad antibacteriana in vitro Método de KIRBY-BAUER Escherichia coli ATCC Staphylococus aureus ATCC Haemophilus influenzae ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Esquema N 1: Flujograma de investigación. 48

63 Diagrama de Flujo del Procedimiento General para la prueba de Susceptibilidad Para la interpretación de los resultados se consideraron 3 categorías: Inhibición del crecimiento, a todo halo translúcido detectado alrededor del disco, es decir que la bacteria es sensible al compuesto. No inhibición del crecimiento, es decir que no se forma halo y la bacteria no es sensible. Se presenta en la tabla como (NI) Inhibición del crecimiento en forma irregular, es decir que se observa una inhibición pero el halo no adopta la forma esperada. Se presenta en la tabla como (II) Las soluciones de terpenoides utilizadas para embeber los discos poseen un grado de pureza del 99%. 49

64 Procedimiento Experimental Recolección y Procesamiento de las Muestras La muestra botánica fue envuelta en papel periódico y puesta en costales desinfectados para su transporte al Laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) ubicado en la Av. Freyre N Iquitos. Con la muestra botánica recolectada se anotaron los datos referente a la especie y fecha de colecta, luego parte de la muestras botánica se prenso y fue sometido al proceso de secado a temperatura de 40º C, luego las muestras pasaron al montaje sobre cartulina y se etiquetaron consignándose los siguientes datos, según anexo Nº Identificación Taxonómica de la Muestra Vegetal La identificación taxonómica de la especie colectada fue identificada en el Herbarium Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana, con la asesoría de un botánico, el cual determinó la categoría taxonómica según el sistema de clasificación de Engler & Prantil modificado por Melchor (44) Preparación de Materia Prima Con la finalidad de adecuar la materia prima para el proceso de extracción, se realizaron operaciones previas, según los protocolos estandarizados descritas en las referencias bibliográficas (38, ) 50

65 Limpieza Se eliminó cuidadosamente el polvo y la tierra adherida, de preferencia se utilizaron cuchillos de acero inoxidables de hoja roma Lavado Tuvo por finalidad eliminar los últimos vestigios de tierra, se realizó mediante un flujo continuo de agua potable a temperatura ambiente y luego se dejó escurrir y se dio un oreado por seis (06) horas para eliminar el exceso de humedad Cortado Debido a que la muestra debe ser secada, se recomienda cortarlas en hojuelas de 1 cm para facilitar la operación de secado. Esto se realizó en forma manual con ayuda de cuchillos de acero inoxidable. Para los tallos se cortaron en fragmento menor de 1 cm, también para facilitar la operación de secado Secado Se realizó para facilitar el proceso de extracción; se hicieron pruebas con un secador de bandejas a 60ºC, secado natural bajo el sol y secado natural bajo cobertizo. El tiempo total de secado estuvo comprendido entre una a dos semanas y la humedad final de la materia prima varió entre 12 y 13% Molienda Se utilizó un molino de martillo de malla intermedia para obtener un mayor número de partículas, haciéndolo más eficiente la extracción al aumentar la superficie de contacto. 51

66 Obtención del extracto etanólico El extracto se obtuvo por maceración en frio (a temperatura ambiente) añadiendo el disolvente (etanol 70%) durante 7 días. Luego se filtró en contenido y se vacío en un Erlenmeyer, la concentración del extracto se realizó por eliminación de disolventes a presión reducida en un rotavapor, a una temperatura de 46ºC y a una presión de 690 mnhg por espacio de 3 horas aproximadamente, posteriormente se dejó secar a temperatura ambiente por 7 días. (Ver foto 7 en anexo Nº 05) Determinación del Rendimiento Para el cálculo de los porcentajes de rendimientos se utilizará la siguiente ecuación tanto para la hoja como para el tallo: Peso del extracto % Rendimiento = x 100 Peso de la muestra total Tamizaje Fitoquímico El tamizaje fitoquímico se realizó en el laboratorio de Fitoquímica del IMET- EsSalud, siguiendo la Guía para el Tamizaje Fitoquímico de Rodríguez (2005) (38, 47). (ver anexo N 6) 52

67 Evaluación de la Actividad Antimicrobiana Preparación del Inóculo Con un asa bacteriológica se tocan cuatro o cinco colonias bien aisladas del mismo tipo morfológico y se inoculó en 4 ml de caldo Mueller Hinton. Los cultivos de caldo se dejaron incubar por 2 horas a 35 C hasta la aparición de una turbidez ligeramente visible. La turbidez se ajustó con caldo cerebro-corazón (BHI) para obtener una turbidez visualmente comparable a la del estándar (0.5 de Mc Farland). Luego de preparado el inóculo bacteriano con la cepa en estudio se realizaron los siguientes pasos: Se introdujo un hisopo estéril en el inóculo bacteriano preparado, de manera de embeberlo completamente. Antes de retirarlo se escurrió sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de líquido del mismo. Se sembró la placa de Mueller Hinton de manera de obtener un crecimiento confluente, para lo cual se realiza estría con el hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repitió el procedimiento rotando la placa 60 en dos oportunidades más. Se dejó secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos. Se colocó los discos, los cuales fueron colocados con pinza estéril. Luego de estar sobre el agar se presionó los discos levemente para que quedaran adheridos al mismo. Deben estar a más de 15 mm del borde de la placa y deben distribuirse de manera de que no haya superposición de los halos de inhibición. En las placas de 100 mm se colocó 5 discos. Luego de colocados los discos las placas se incubaron a 37 C durante 18 horas. Las placas se colocaron en forma invertida para evitar que el agua condensada no caiga sobre el agar, lo cual hubiese cambiado las condiciones del medio de cultivo y por lo tanto no serviría para la lectura de los halos. 53

68 Preparación de los Discos de Sensibilidad Con un perforador estéril se perforó papel filtro Whatman No. 1 (Whatman International Ltd. England), obteniéndose discos de 5.5mm de diámetro. De cada una de las diluciones de 2, 4, 8, 16, 32 y 64 mg/ml de los extractos etanólico tanto de hojas como de tallo, se procedió a preparar los discos de sensibilidad añadiendo 15 L., de las soluciones en discos de papel Aplicación de los Discos Se aplicó los discos usando unas pinzas ligeramente flameadas Se presionó los discos ligeramente contra el Agar. Se usó 5 discos por placa Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se basó en las normas de la NCCLS. Se preparó Caldo Nutritivo en tubos con tapa rosca en los que se añadieron los extractos etanólico de las hojas y del tallo preparados a concentraciones finales de 2, 4, 8, 16, 32 y 64 mg/ml, se autoclavarón los tubos a 125º C a 15lb de presión, luego de atemperar los tubos a 37º C se sembrará 10 7 UFC de las bacterias control en los tubos con Caldo Nutritivo BHI, se incubarán a 37º C por 48 horas. Luego se tomó 15µl del cultivo y se añadió al caldo nutritivo BHI, los que se incubaron a 37º C por 48 horas, al cabo de ese tiempo se registró la turbidez de los tubos. Al cabo de 24 horas se observa la turbidez de los tubos que indicara desarrollo bacteriano. La concentración del extracto etanólico de las hojas y del tallo que presente ausencia de crecimiento, es detectada por falta de turbidez (igualando al control negativo), que se designa como la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI). 54

69 Figura Nº 16. Fundamento de la determinación de la mínima concentración inhibitoria y de la mínima concentración bactericida, mostrando las diferencias entre estas dos variables. 55

70 3.2.- POBLACIÓN Y MUESTRA Población en Estudio Lo constituyen las unidades de las especies vegetales de: Clibadium surinamense L. (Huaca) Muestra en Estudio La muestra vegetal lo constituyen las hojas frescas y tallo de: Clibadium surinamense L. (Huaca) Selección de las Muestras Botánicas La selección de las muestras botánicas a estudiar, se realizará tomando en cuenta los siguientes criterios: Arbustos jóvenes de tamaño mediano de Clibadium surinamense L. (Huaca) Hojas sanas de Clibadium surinamense L. (Huaca) Tallo joven libre de hongos y musgo de Clibadium surinamense L. (Huaca) 56

71 Lugar de Muestreo Las muestras botánicas de Clibadium surinamense L. huaca fue colectado en la comunidad de SAN ANDRES, ubicado en las coordenadas geográficas de latitud sur 3º 41 2, longitud 73º 16 43, y una altura de 92 m.s.n.m. (coordenadas Universal de Transversal de Mercator -UTM-, x 691,155.29, y 9 591,999.76); La cual abarca una superficie de 10 ha, con una temperatura media mensual que oscila entre 20º C y 33º C; del Distrito de Villa Punchana, Provincia de Maynas del Departamento de Loreto. El lugar de muestreo se eligió debido a que la comunidad realiza su pesca artesanal con huaca y cuenta con Clibadium surimanense L. de diferentes especies INSTRUMENTOS Material Vegetal El material vegetal serán los extractos etanólico de las hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) Material Biológico en Estudio Staphylococcus aureus ATCC Haemophilus influenzae ATCC Pseudomona aeruginosa ATCC Escherichia coli ATCC Medios de Cultivos Agar Mueller Hinton 57

72 Materiales de Vidrio Balón Erlenmeyer de 250 y 500 ml. Matraz 1000 ml. Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml. Peras de separación Placas Petri de 150 mm y 100 mm Probetas de 10, 100, 250 y 1000 ml. Tubos de ensayo de 5 y 7 ml. Vasos precipitados de 5, 10, 20, 50 y 100 ml Materiales de Plástico Hisopos estériles Micropipetas graduables de 10, 100 y 1000 µl (Labsytem) Tip s 200 y 1000 µl Material de Metal Asa de siembra bacteriológica que termina en aro. Escobillas para tubos. Gradilla metálica. Machete Pinza estéril. Tijera 58

73 Otros Materiales Medidor de halo antimicrobiano (vernier) Detergente. Guantes quirúrgicos. Mascarillas. Papel periódico Papel filtro Equipos Autoclave Balanza analítica Cámara fotográfica profesional Cocina eléctrica Destilador de aceite Incubadora con una temperatura que se regula entre 60 y 65 C Refrigeradora Reactivos Agua destilada Suero fisiológico estéril Ácido sulfúrico Cloruro de Bario 59

74 3.4.- ANÁLISIS DE DATOS Los datos fueron procesados mediante el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey con un nivel de significancia de 0,05% y 0,01%, que permitió establecer muchas diferencias entre los tratamientos. Los datos obtenidos de los tratamientos de cada una de las especies bacterianas se procesaron mediante el Software estadístico SPSS versión 18.0 para Windows PROTECCION DE LOS DERECHOS HUMANOS La cantidad de las muestras a utilizar, no involucra grandes cantidades de las hojas, que ponga en peligro la especie o atente contra la conservación de la biodiversidad. El área de microbiología, donde se realizará los ensayos experimentales, constituye un medio ambiente de trabajo especial que pueden presentar riesgos de enfermedades infecciosas para las personas que trabajan en el laboratorio o cerca de él. Por ellos se contará con las estrictas medidas de bioseguridad (118). El manejo de las cepas microbianas será realizado por el personal especializado del Laboratorio, la cual no involucra grandes cantidades de material biológico que ponga en riesgo la bioseguridad de la institución, la integridad física del personal que labora en la misma o atente contra la vida ni de los tesistas ni de los asesores CUESTIONES ÉTICAS EN LA EXPERIMENTACIÓN Los avances técnicos-científicos en estos últimos años han conducido a fortalecer el criterio de la evaluación de riesgo mutagénico, en especial el riesgo carcinogénico. En la misma medida que estos conocimientos se han revelado; y teniendo en consideración la responsabilidad ética (e incluso económica) de salvaguardar la salud y el bienestar de los animales de experimentación, preservándolos de cualquier daño, dolor y sufrimiento innecesario antes, durante y después del período del estudio (119, 120), se ha hecho evidente la necesidad de desarrollar nuevos modelos de evaluación de potencial mutagénico, que permitan aplicar la Regla de 3 R (Reducción, Refinamiento, Reemplazo) (119), en la cual podamos Reducir a cero el número de animales. 60

75 CAPÍTULO IV RESULTADOS RESULTADOS Determinación del Screening Fitoquímico de hojas y tallo de C. surinamense L. TABLA N 4 Screening Fitoquímico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. Pruebas Resultados (*) Extracto Etanólico de hojas Extracto Etanólico del tallo Metabolitos Dragendorff Alcaloides Liebermann Buchard Triterpenos esteroides Borntrager 0 0 Quinonas Baljet 0 + Cumarinas Reactivo de Sudan 0 0 Aceites esenciales y grasas Reactivo de Fehling 0 + Azúcares reductores Prueba de espuma Saponinas Cloruro Férrico 0 0 Fenoles y taninos Ninhidrina 0 0 Aminas y aminoácidos Reactivo Kedde 0 0 Glucósidos cardiotónicos Reactivo Shinoda Flavonoides Tacto 0 0 Mucílagos Sabor + + Principios amargos y astringente Molish ++ 0 Glucósidos Resultados: (+++) Abundante; (++) moderado; (+) levemente; (±) escasamente; (0) ausente En la tabla N 1 se puede observar los resultados de los principales grupos fitoquímicos o metabolitos secundarios investigados en hoja y tallo de Clibadium surinamense L. determinado en el Extracto Etanólico (EE). Se han analizado cualitativamente mediante pruebas colorimétricas y precipitación, los cuales permite una rápida identificación con reactivos sensibles y reproducibles. 61

76 Determinación del Rendimiento de hojas y tallo de C. surinamense L. TABLA N 5 Rendimiento del EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. Nombre Científico Parte Utilizada Rendimiento (%) Clibadium surinamense L Hojas 6.83 % Clibadium surinamense L Tallo 8.91 % GRAFICO N 1 Porcentaje de rendimiento del EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. Rendimiento 9.00% 8.00% 7.00% 6.00% 5.00% 4.00% 3.00% 2.00% 1.00% 0.00% Huaca Huaca Hojas Huaca Hojas Tallo Tallo Huaca El gráfico 1, representa el rendimiento en porcentaje, de cada uno de las partes utilizadas del Clibadium surinamense L. obtenidos por rotavapor. En la Tabla Nº 5 se determinó el rendimiento de cada parte utilizada (hojas y tallo) de Clibadium surinamense L. Puede observarse que el tallo presenta mayor rendimiento (8.91 %), mientras que las hojas es la menos abundante (6.83 %). 62

77 Resultados de los Diámetros de Halos de Inhibición TABLA Nº 6 Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a Staphylococcus aureus ATCC (Diámetro de la zona de inhibición, mm). Conc. Extracto Etanólico Amikacina (B) Gentamicina (A) Penicilina G Ampicilina (A) Ceftriaxona (B) Cloranfenicol (C) disco (30 µg) disco (10 µg) disco (10 UI) disco (10 µg) disco (30 µg) disco (30 µg) mm mm mm HOJA TALLO R I S R I S R I S R I S R I S R I S mg/ml mm mm < >15 <28 -- >29 < >18 T 1 2 NA NA T 2 4 NA NA T 3 8 NA NA T ± 1.89 NA T ± 1.90 NA T ± ± 1.24 NP ± ± 1.00 NP NP ± 0.96 NP: no probado NA: no activo A: Grupo A B: Grupo B C: Grupo C 63

78 GRÁFICO 2 Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadium surinamense L. en disco frente a Staphylococcus aureus ATCC El grafico 2, se muestra los promedios de halos de inhibición producido por las diferentes concentraciones del extracto etanólico de hojas de Clibadium surinamense L (huaca). Se aprecia que el tratamiento t6 o concentración de 64 mg/ml obtuvo el mayor promedio (10.72 ± 1.05 mm), seguido del tratamiento t5 con 8.72 ± 1.90 mm y t4 con 1.72 ± 1.89 mm, los tratamiento t1, t2 y t3 no hubo crecimiento alguno (ver Tabla Nº 4). El grafico 2, también se observa que en el extracto etanólico del tallo de Clibadium surinamense L (huaca) no hubo halos de inhibición hasta el t6 (64 mg/ml) 64

79 TABLA Nº 7 Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a Haemophilus influenzae ATCC (Diámetro de la zona de inhibición, mm). Conc. Extracto Etanólico Amikacina (B) Gentamicina (A) Penicilina G Ampicilina (A) Ceftriaxona (B) Cloranfenicol (C) disco (30 µg) disco (10 µg) disco (10 UI) disco (10 µg) disco (30 µg) disco (30 µg) mm mm mm HOJA TALLO R I S R I S R I S R I S R I S R I S < mg/ml mm mm > > 26 < > 29 T 1 2 NA NA T 2 4 NA NA T 3 8 NA NA T 4 16 NA NA NP NP NP ± ± ± 1.73 T ± 1.05 NA T ± ± 1.19 NP: no probado NA: no activo A: Grupo A B: Grupo B C: Grupo C 65

80 GRÁFICO 3 Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadium surinamense L. en disco frente a Haemophilus influenzae ATCC El grafico 3, se muestra los promedios de halos de inhibición producido por las diferentes concentraciones del extracto etanólico de hojas de Clibadium surinamense L (huaca). Se aprecia que el tratamiento t6 (64 mg/ml) obtuvo el mayor promedio (4.43 ± 1.56 mm), seguido del tratamiento t5 con 1.95 ± 1.05 mm, los tratamiento t1, t2, t3 y t4 no hubo crecimiento alguno (ver Tabla Nº 5). El grafico 3, también se observa que en el extracto etanólico del tallo de Clibadium surinamense L (huaca) no hubo halos de inhibición hasta el T6 (64 mg/ml) con un halo de inhibición promedio de 1.42 ± 1.19 mm 66

81 TABLA Nº 8 Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a Pseudomona aeruginosa ATCC (Diámetro de la zona de inhibición, mm). Conc. Extracto Etanólico Amikacina (B) Gentamicina (A) Penicilina G Ampicilina (A) Ceftriaxona (B) Cloranfenicol (C) disco (30 µg) disco (10 µg) disco (10 UI) disco (10 µg) disco (30 µg) disco (30 µg) mm mm mm -- HOJA TALLO R I S R I S R I S R I S R I S R I S mg/ml mm mm << >17 < >15 < >21 < >18 T 1 2 NA NA T 2 4 NA NA T 3 8 NA NA T 4 16 NA NA ± ± 1.18 NP NP ± 0.19 NP T 5 32 NA NA T 6 64 NA NA NP: no probado NA: no activo A: Grupo A B: Grupo B C: Grupo C 67

82 GRÁFICO 4 Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadium surinamense L. en disco frente a Pseudomona aeruginosa ATCC El grafico 4, se muestra los promedios de halos de inhibición producido por las diferentes concentraciones del extracto etanólico de Clibadium surinamense L (huaca). Se aprecia que no hubo halo de inhibición alguno en ninguna de los 6 tratamientos (concentraciones) tanto en hojas como en el tallo (ver tabla N 6) 68

83 TABLA Nº 9 Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a Escherichia coli ATCC (Diámetro de la zona de inhibición, mm). Conc. Extracto Etanólico Amikacina (B) Gentamicina (A) Penicilina G Ampicilina (A) Ceftriaxona (B) Cloranfenicol (C) disco (30 µg) disco (10 µg) disco (10 UI) disco (10 µg) disco (30 µg) disco (30 µg) mm mm mm mm mm HOJA TALLO R I S R I S R I S R I S R I S R I S mg/ml mm mm < >17 < > 15 < >17 < >21 < >18 T 1 2 NA NA T 2 4 NA NA T 3 8 NA NA T 4 16 NA NA T 5 32 NA NA T ± 1.39 NA ± ± 1.31 NP ± ± ± 1.05 NP: no probado NA: no activo A: Grupo A B: Grupo B C: Grupo C 69

84 GRÁFICO 5 Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadium surinamense L. en disco frente a Staphylococcus aureus ATCC El grafico 5, se muestra los promedios de halos de inhibición producido por las diferentes concentraciones del extracto etanólico de hojas de Clibadium surinamense L (huaca). Se aprecia que el tratamiento t6 (64 mg/ml) obtuvo un mayor promedio de 1.77 ± 1.39 mm, los tratamiento t1, t2, t3, t4 y t5 no hubo crecimiento alguno (ver Tabla Nº 7). En el extracto etanólico del tallo de Clibadium surinamense L (huaca) no hubo halos de inhibición alguno. 70

85 CUADRO N 1 Análisis de varianza (ANOVA) para comparar la actividad antibacteriana del EE de Clibadium surinamense L. a través de la variación de promedios de halo de inhibición frente a Staphylococcus aureus ATCC entre las diferentes concentraciones o tratamientos empleados. Fuentes de variabilidad Grados de libertad Suma de Cuadrados Cuadrado medio F calculado F tabular Significación Tratamientos , , ,511 2,440 3,490 ** Error 42 52,385 1,247 Total ,309 CV. 4,907 % ** Diferencias altamente significativas ns no significativo En el grafico 5, se observa los resultados del análisis de varianza (ANOVA), de los promedios de los halos de inhibición producidas a diferentes concentraciones o tratamientos del EE de Clibadium surinamense L. a niveles de confiabilidad al 95 % y 99 % con 6 y 42 grados de libertad. Siendo F calculado de 329,511 mayores a los valores del F tabular que nos indica que existen diferencias estadísticas altamente significativas entre los promedios de tratamientos, siendo el coeficiente de variabilidad de 4,907 % aceptable para las condiciones del ensayo, por lo tanto los datos son confiables. 71

86 CUADRO N 2 Prueba de significación de Tukey para actividad antibacteriana del EE de Clibadium surinamense L. frente a Staphylococcus aureus ATCC por el método de difusión del disco (Kirby Bauer). Orden Significancia Tratamientos (mm) de mérito α mg/ml ± 1.05 a 2 32 mg/ml 8.72 ± 1.90 a 3 16 mg/ml 1.72 ± 1.89 b 4 8 mg/ml 0 c 5 4 mg/ml 0 d 6 2 mg/ml 0 e En el Cuadro 2, se expresa la prueba de significación de Tukey al 95% de confiabilidad se observa los promedios de los tratamientos o concentraciones, donde destacan con la mayor concentración 64 mg/ml con ± 1.05 mm y el 32 mg/ml con 8.72 ± 1.90 mm, en el tercer lugar se ubica el 16 mg/ml con 1.72 ± 1.89 mm, las concentraciones que no tuvieron halos de inhibición fueron 8 mg/ml, 4 mg/ml y 2 mg/ml respectivamente. 72

87 GRÁFICO 6 Medias e intervalos de Tukey HSD al 95,0 En el Grafico 6, se muestra las medias e intervalos de Tukey HSD al 95,0%, se puede apreciar las diferencias significativas entre los tratamientos t6, t5 y t4, el resto de los tratamientos no hubo halos de inhibición promedio. 73

88 4.2.- DISCUCION El método utilizado para la obtención del extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) fue la destilación por arrastre con vapor de agua. Esta técnica es muy utilizada a pequeña escala y a escala industrial debido a su alto rendimiento, la pureza del extracto obtenido y porque no se requiere tecnología sofisticada (38, 47). El estudio de las características farmacognósticas del extracto etanólico de las hojas y tallo de Clibadium surinamense L. se realizaron mediante protocolos descritas en las referencias bibliográficas. Del tamizaje fitoquímico se obtuvieron respuesta positiva para una gran diversidad de grupos funcionales, se comprobó la presencia de flavonoides, alcaloides en mayor abundancia (+++) en los extractos etanólico de ambas partes (hojas y tallo), además de abundante (+++) triterpenos esteroides y saponinas solamente en el extracto etanólico de las hojas en comparación con el tallo, el cual se puede ver que hay una leve (+) presencia de triterpenos esteroidales, saponinas, moderada (++) presencia de flavonoides y abundantes alcaloides (+++). También se hay presencia leve (+) de azúcares reductores. También se determinó que el extracto etanólico de las hojas y tallo carece de grupos fitoquímicos como mucilagos, glucósidos cardiotónicos, fenoles y taninos, quinonas; se identificó una mínima cantidad de principios amargos y astringente, azúcares reductores y cumarinas en el extracto etanólico del tallo de Clibadium surinamense L. Para la técnica se empleó el inoculo estandarizado de 1,5 x 10 8 UFC, recomendado para bacterias, que asegura un mejor desarrollo de las colonias de las especies. El diluyente que se utilizó fue el dimetilsulfóxido (DMSO), que es un líquido incoloro, que se utiliza principalmente como solvente industrial. El cual es un disolvente aprótico de baja toxicidad y a la vez recomendado por la NCCLS en las pruebas de sensibilidad para bacterias. No observándose en ninguno de los casos efecto del solvente sobre las células bacterianas, por lo que los resultados son sólo imputables al extracto etanólico. 74

89 De los resultados obtenidos, en la tabla 6 y grafico 2, se aprecia la evaluación de la actividad antibacteriana del extracto etanólico de Clibadium surinamense L. (huaca) frente a Staphylococus aureus ATCC 25923, por el método de difusión del disco (Kirby Bauer) la sensibilidad de la bacteria empieza en el t4 con un halo promedio de 1.72 ± 1.89 mm (16 mg/ml) pero alcanzo un mayor diámetro de halo de inhibición en el T6 (64 mg/ml) con un halo promedio de ± 1.05 mm; lo que indica que a mayor concentración mayor halo de inhibición; sin embargo, comparando con los halos de inhibición de los controles positivos tenemos ± 0.96 mm para cloranfenicol (30µg), ± 1.05 mm para gentamicina (10 µg) y ± 1.00 mm para penicilina (10 UI), la mayor dosis del EE de hojas de C. surinamense (t6 = 64 mg/ml) no iguala ni mucho menos supera a la dosis más mínima (24.84 ± 0.96 mm) del halo de inhibición del control positivo (cloranfenicol). El EE del tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) frente a Staphylococus aureus ATCC 25923, solo presento halo de inhibición a 64 mg/ml (t6) con 1.55 ± 1.24 mm en promedio En la tabla 7 y grafico 3, se observó que aparecen halos de inhibición recién a t5 (32 mg/ml) y t6 (64 mg/ml) del EE de hojas de Clibadium surinamense L. (huaca) con 1.95 ± 1.05 mm y 4.43 ± 1.56 mm respectivamente frente a Haemophilus influenzae ATCC 49247, sin embargo el EE del tallo solo presenta halo de inhibición a t6 (64 mg/ml) con 1.42 ± 1.19 mm. En la tabla 8 y grafico 4, se observó el EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) no presentaron halos de inhibición frente a Pseudomona aeruginosa ATCC 27853, además en la tabla 9 y grafico 5, se observa también, que el EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) no presentaron halos de inhibición frente a Escherichia coli ATCC 25922, salvo la última dosis de 64 mg/ml del EE de hojas, presento un halo de inhibición promedio de 1.77 ± 1.39 mm, el cual se puede asegurar que el EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) no presenta actividad antibacteriana frente a bacterias Gram Negativa (Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC 25922) 75

90 Las concentraciones de 16, 32 y 64 mg/ml del EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) no se consideran actividad antimicrobiana; de acuerdo al trabajo realizado por Salinas et al. (2009) donde reconocen que la concentración del extracto crudo que se puede utilizar como antimicrobiano es de 2.5 a 8 mg/ml (121). Es importante mencionar que para esta especie, tanto para el tallo y las hojas no se determinaron la CMI debido a que los tratamientos más concentrados no superaron los halos de inhibición promedio en comparación con los controles positivos, además los halos de inhibición presentaron halos de inhibición superiores a 15 y 60 mg/ml frente a Staphylococus aureus ATCC (121). Otras posibles explicaciones corresponden a la posibilidad que el compuesto activo no alcance el sitio blanco de acción o bien, la estructura de las porinas impida el paso del principio activo del aceite esencial al interior de la célula bacteriana (88). Es conocido que bacterias Gram Negativas poseen una membrana adicional denominada Estructura OM la cual les confiere un mayor grado de resistencia a los agentes antimicrobianos (122, 123). Cabe señalar que es sumamente difícil estandarizar un procedimiento para el estudio de las plantas como antimicrobianos, ya que existen diversos factores que están involucrados y que pueden influir de manera importante en los resultados obtenidos; se puede mencionar, la composición del medio de cultivo, método de extracción, ph, solubilidad de la muestra en el medio de cultivo, y el microorganismo en cuestión (38, 47). Además la sensibilidad de los organismos Gram positivo, en general, es mayor que la de los organismos Gram negativos (79-84). La función primordial de muchos metabolitos secundarios no es necesariamente antibacteriana o antifúngica. Algunos inhiben la germinación de esporas. Varía también su localización en los tejidos. Los compuestos antipatógenos se alojan principalmente en el exterior de los tejidos y órganos o en el interior de las vacuolas. Los compuestos ubicados en el exterior se hallan asociados por enlaces covalentes o disueltos en una matriz, tal como la pared celular o las cutículas que recubren el exterior de los órganos vegetales. Las agliconas de muchos flavonoides aparecen depositadas, incluso en forma cristalina, en el exterior de las hojas (124). 76

91 En este contexto, se puede hipotetizar que el EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca), no tienen actividad antibacteriana significativa sobre bacterias Gram Negativas (Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC 25922), lo que podría atribuirse a la baja concentración de los constituyentes químicos presentes en el vegetal con actividad antimicrobiana o quizá a la acción antagónica que ejercen sobre ellos otro grupo de compuestos, así como también porque las bacterias Gram Negativas presentan compuestos anfipáticos que operan como bombas de expulsión de diversas sustancias, por lo cual, el principio activo y/o fitocomplejo antibacteriano es expulsado de manera inmediata, sin alcanzar a cumplir el efecto (104). Al efectuar el análisis de varianza para el promedio en tamaño de los halos de inhibición sobre Staphylococus aureus ATCC (ver cuadro 1, 2 y grafico 6) se observó que existen diferencias altamente significativas entre los tratamientos, siendo el coeficiente de variabilidad de 4,907 %. Por lo que al realizar la prueba de Tukey (cuadro 2) se confirmó que el T6 (64 mg/ml) tuvo mayor actividad pero de poca significancia estadística para Staphylococus aureus ATCC

92 4.3.- CONCLUSIONES El extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) no presenta actividad antibacteriana in vitro frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC Se obtuvo un rendimiento de los extractos etanólico de las hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) en un porcentaje de 6.83 % y 8.91 %, extraídos mediante rotavapor. El tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) evidencio abundante presencia de alcaloides, triterpenosesteroides, flavonoides y saponinas, reportándose en pequeñas proporciones principios amargos - astringentes y glicósidos. El grado de sensibilidad bacteriana de Staphylococcus aureus ATCC por difusión del disco (método de Kirby-Bauer), es sumamente resistente a concentraciones de 2 a 64 mg/ml y que las concentraciones mayores a 16 mg/ml los halos de inhibición no superaron el diámetro de los controles positivos, concluyendo así que el extracto etanólico de tallo y hojas de Clibadium surinamense L. (huaca) no presenta actividad antibacteriana frente a Staphylococcus aureus ATCC Todas las cepas gran negativas de Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC y Escherichia coli ATCC presentaron resistencia a las diferentes concentraciones ensayadas (método de Kirby-Bauer) del extractos etanólico de tallo y hojas de Clibadium surinamense L. (huaca) No se realizó la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (huaca) debido que no presentaron halos de inhibición significativas en el método de Kirby-Bauer 78

93 4.4.- RECOMENDACIONES Se recomienda buscar más financiamiento debido a que es muy difícil conseguir cepas referenciales para hacer este tipo de estudio Desarrollar otros ensayos para corroborar la sensibilidad antifúngica de esta especie y así validar los resultados obtenidos en este estudio. Se recomienda realizar fraccionamiento, aislamiento y purificación de los componentes más abundantes que se encuentre en la especie botánica de Clibadium surinamense L. (huaca) como alcaloides, flavonoides y triterpenos-esteroides para corroborar estos resultados y así confirmar su actividad antibacteriana 79

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111 4.6.- ANEXO ANEXO Nº 1 DATOS DE PASAPORTE DE COLECCIÓN DE ESPECIES DE LAS PLANTAS MEDICINALES EN ESTUDIO FICHA DE CAMPO Nº de Ficha:. DATOS GENERALES: Lugar de colección:....distrito:...provincia:.... Fecha:..Tipo de Bosque:.. Coordenadas UTM: (X).. (Y).... Tipo de Suelo:..Otras características:... Nombre del Colector:..Nº Colección:.. TAXONOMÍA: Familia Vegetal:.. Nombre Científico:.. Nombre Vulgar:.. CARACTERISTICAS VEGETALES: Habitad:..Estadio Productivo... Posición de Hojas:.Presencia de Órganos Accesorios en Hojas:. Forma del Tallo:.Órganos Accesorios en Tallo: Características de la Corteza:. Látex:.Color de Látex:.... Tipo de Inflorescencia:.Posición de Inflorescencia:... Tipo de Flor por Sexo:...Nº de Pétalos:...Unión de Sépalos:... N de Estambres:...Posición de Estambres:... Posición de Ovarios:...Nº de Carpelos:... Tipo de Fruto:.Consistencia:....Dehiscencia:.... DATOS ETNOFARMACOLÓGICOS: Uso Medicinal 1:. Parte Usada:... Cantidad Usada 1: Forma de Preparación:... Uso Medicinal 2:. Parte Usada:... Cantidad Usada 2: Forma de Preparación:... COLECTA DE MATERIAL BIOLÓGICO: Peso:... Parte Colectada:... Observaciones: 97

112 ANEXO Nº 2 98

113 ANEXO Nº 3 RECOLECCIÓN DE LAS MUESTRAS BOTÁNICAS 2 1 FOTO Nº 01-03: fotografía in situ de la muestra botánica Clibadium surinamense L. huaca de la comunidad de SAN ANDRES, (coordenadas UTM-, x 691,155.29, y 9 591,999.76) 99

114 ANEXO Nº 4 PESADA Y SECADO DE LAS MUESTRAS BOTÁNICAS COLECTADAS 6 FOTO Nº 04-05: secado y molienda de las hojas frescas y tallo de Clibadium surinamense L. huaca realizados en el Laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) ubicado en la Av. Freyre N Iquitos

115 ANEXO Nº 5 Obtención del Extracto Etanólico del tallo y hojas de Clibadium surinamense L. FOTO Nº 06: Proceso de extracción etanólico de las hojas y tallos de Clibadium surinamense L. huaca mediante extracción en rotavapor realizados en el laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) FOTO Nº 07: Proceso de filtrado y obtención del extracción etanólico de las hojas y tallos de Clibadium surinamense L. huaca realizados en el laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) 101

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