UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ODONTOLOGÍA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN, TITULACIÓN Y GRADUACIÓN


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1 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ODONTOLOGÍA UNIDAD DE INVESTIGACIÓN, TITULACIÓN Y GRADUACIÓN EFECTO INHIBIDOR DEL ACEITE ESENCIAL DE Matricaria chamomilla MANZANILLA EN COMPARACIÓN AL PARAMONOCLOROFENOL ALCANFORADO Y GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 2% SOBRE CEPAS DE Enterococcus faecalis. ESTUDIO IN VITRO TRABAJO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE ODONTÓLOGA AUTORA HILDA MAGALY FARINANGO ANAGUANO TUTORA Dra. MARÍA ISABEL ZAMBRANO QUITO-ECUADOR 2013

2 DECLARACIÓN ii

3 AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL iii

4 CERTIFICACIÓN iv

5 INFORME DE APROBACIÓN DEL TUTOR v

6 CERTIFICADO DEL TRIBUNAL vi

7 DEDICATORIA El presente trabajo está dedicado a Dios por ser mi luz, esperanza y fortaleza, demostrándome cada día que su amor es inmensamente grande. A mis padres Héctor y Aurora por su amor, comprensión, esfuerzo y apoyo incondicional durante este largo camino, ustedes fueron el pilar fundamental que me permitió alcanzar la meta. A mis hermanos Fredy y Nancy gracias por estar a mi lado y apoyarme desde siempre, espero algún día recompensar todo lo que han hecho por mí. Esta obra se las dedico con todo mi amor Magaly vii

8 AGRADECIMIENTO A la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Odontología a todos los docentes y demás personas que aportaron de una u otra manera en nuestra formación profesional. A mi asesora de tesis la Dra. María Isabel Zambrano, miembros del jurado examinador Dra. Alba Coloma, Dra. Sandra Macías y Dra. Daniela Hidalgo por su colaboración en la realización, revisión y evaluación de este trabajo investigativo. De manera especial al Bioq. José Luis Moreno por su supervisión en el proceso de obtención del aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla, a la MSc Dayana Borja Espín por su ayuda y guía en la realización del trabajo práctico de laboratorio y a la Dra. Alba Coloma por brindarme su tiempo y conocimientos de manera desinteresada para la revisión final de esta investigación. viii

9 UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ODONTOLOGÍA EFECTO INHIBIDOR DEL ACEITE ESENCIAL DE Matricaria chamomilla MANZANILLA EN COMPARACIÓN AL PARAMONOCLOROFENOL ALCANFORADO Y GLUCONATO DE CLORHEXIDINA AL 2% SOBRE CEPAS DE Enterococcus faecalis. ESTUDIO IN VITRO AUTORA: Hilda Magaly Farinango Anaguano TUTORA: Dra. María Isabel Zambrano FECHA: 21 de julio del 2014 RESUMEN Una de las principales causas de la infección endodóncica pos-tratamiento es la permanencia de microorganismos al interior de los conductos radiculares, siendo el Enterococcus faecalis una de las especies más prevalentes. El objetivo de este estudio fue determinar el efecto antimicrobiano del aceite esencial de manzanilla en relación al paramonoclorofenol alcanforado y gluconato de clorhexidina al 2% sobre cepas de E. faecalis. La obtención del aceite esencial de manzanilla se efectuó con el método por arrastre de vapor, utilizando tween 80 como agente coadyuvante de dilución para obtener las concentraciones de 25%, 50% y 75%, las cepas de E. faecalis fueron reactivadas por 24 horas a 37 C, posteriormente utilizando como medio de cultivo Agar Mueller Hinton, se procedió a realizar la siembra bacteriana en 15 placas petri, elaborando en cada una pozos de 6 mm de diámetro en los cuales se colocaron 100 ul de las sustancias experimentales, se incubaron las placas a 37 C y se registraron las medida de los halos de inhibición a las 24 y 48 horas de exposición. Los datos obtenidos fueron analizados por medio del test estadístico ANOVA concluyendo que existieron diferencias significativas en el halo de inhibición provocados por las sustancias experimentales tanto a las 24 y 48 horas (p=0), el test post Hoc de Bonferroni en el cual no se encontró diferencia significativa entre la inhibición de Manzanilla al 100%, Gluconato y Paramonoclorofenol (>0,05), y el test T de Student que determinó que a mayor tiempo de exposición mayor inhibición (p=0). Palabras clave: Enterococcus faecalis, manzanilla, halo de inhibición. ix

10 ABSTRACT x

11 TABLA DE CONTENIDOS Página DECLARACIÓN ii AUTORIZACIÒN DE LA AUTORÌA INTELECTUAL..... iii CERTIFICACIÓN iv INFORME DE APROBACIÒN DEL TUTOR...v CERTIFICADO DEL TRIBUNAL..... vi DEDICATORIA... vii AGRADECIMIENTO viii RESUMEN... ix ABSTRACT...x TABLA DE CONTENIDOS xi LISTA DE TABLAS.....xiv LISTA DE GRÁFICOS xv LISTA DE FIGURAS......xvi INTRODUCCIÓN CAPITULO I...3 EL PROBLEMA PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN Objetivo general: Objetivos específicos: JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA HIPÓTESIS...6 CAPITULO II...7 MARCO TEÓRICO INFECCIONES ENDODÓNCICAS POS- TRATAMIENTO Participación microbiana en las infecciónes endodóncicas pos-tratamiento Causas del Fracaso en el tratamiento de endodoncia Taxonomía y características generales del Enterococcus faecalis xi

12 2.1.4 Factores de patogenicidad Forma de crecimiento SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS INTRACONDUCTO Medicamentos intraconductos Paramonoclorofenol alcanforado Mecanismo de acción del paramonoclorofenol alcanforado Irrigación y Aspiración en endodoncia Gluconato de Clorhexidina Mecanismo de acción del gluconato de clorhexidina Matricaria chamomilla MANZANILLA Plantas con acción antimicrobiana Clasificación Botánica Descripción Botánica Composición Química Farmacología Uso reportado Efectos adversos CAPITULO III METODOLOGÍA TIPO DE INVESTIGACIÓN MUESTRA DE ESTUDIO O POBLACIÓN Población Muestra CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES PROCEDIMIENTO Y TÉCNICA Obtención del aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla Preparación de las tres concentraciones del aceite esencial de Matricaria chamomilla (manzanilla) Reactivación de la cepa bacteriana Preparación del Inóculo Preparación del agar Mueller Hinton xii

13 3.5.6 Siembra bacteriana Técnica de difusión por pozos Grupos de estudio Colocación de las sustancias experimentales en los pozos RECOLECCIÓN DE DATOS ASPECTOS ÉTICOS...40 CAPITULO IV DISEÑO Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS DISCUSIÓN CAPITULO V CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA...56 ANEXOS...61 xiii

14 LISTA DE TABLAS Página Tabla 1. Especies bacterianas aisladas en infecciones de la pulpa vital, infecciones de la pulpa necrótica e infecciones secundarias o persistentes Tabla 2. Resultados del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 24 horas Tabla 3. Resultados del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 48 horas Tabla 4. Media del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 24 y 48 horas Tabla 5. Resultados de la prueba ANOVA Tabla 6. Resultados de la prueba de Bonferroni para la exposición de 24 horas Tabla 7. Resultados de la prueba de Bonferroni para la exposición de 48 horas Tabla 8. Resultados de la prueba de t Student xiv

15 LISTA DE GRÁFICOS Página Gráfico 1. Resultados del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 24 horas Gráfico 2. Resultados del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 48 horas Gráfico 3. Media del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 24 y 48 horas xv

16 LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. A. Eliminación de barro dentinario B. Persistencia de E. faecalis luego del tratamiento Figura 2. Matricaria chamomilla Figura 3. Cepa de Enterococcus faecalis (ATCC 19433) Figura 4. A. Plantas de Matricaria chamomilla manzanilla B. Proceso de secado de la muestra vegetal Figura 5. A. Twen 80 agente coadyuvante de dilución B. Dilución del aceite esencial de manzanilla con Twen 80 al 50% de concentración Figura 6. A. Medio Tryptic Soy Broth (TSB) B. Preparación del medio TSB y colocación en tubos de ensayo para su posterior esterilización C. Incubación de la cepa a 37 C por 24 horas Figura 7. Escala de Mc Farland 0, Figura 8. A. Agar Mueller Hinton B. Preparación del medio de cultivo C. Colocación del medio de cultivo Agar Mueller Hinton y medio TSB en la autoclave D. Medio de cultivo colocado en placas petri Figura 9. A. Colocación de la suspensión bacteriana en las placas petri B. Utilización del asa digralsky para la siembra bacteriana Figura 10. Elaboración de los pozos con sacabocados Figura 11. A. Sustancias antimicrobianas utilizadas en el estudio B. Colocación de sustancias con micropipeta Figura 12. A. Lectura de las medidas de los halos de inhibición B. Halos de inhibición formados a las 48 horas de exposición en el Grupo 1 C. Halos de inhibición formados a las 48 horas de exposición en el Grupo 2 D. Halos de inhibición formados a las 48 horas de.. 40 xvi

17 INTRODUCCIÓN La cavidad bucal alberga microorganismos que coexisten de manera pacífica con el huésped contribuyendo en gran mayoría con su defensa e impidiendo que los microorganismos de la flora transeúnte la colonicen de manera definitiva provocando un desequilibrio en el estado salud-enfermedad. Generalmente la infección endodóncica está relacionada a microorganismos que en los últimos años han podido ser identificados gracias a la utilización de nuevos métodos de cultivo y nuevas técnicas como la biología molecular con lo cual se ha logrado confirmar la presencia de una variedad de especies que están relacionadas con esta patología. Dentro de los microorganismos más prevalentes en infecciones endodóncicas se encuentran los géneros Porphyromona, Prevotella, Fusobacterium, Peptostreptococcus, entre otros, de los cuales el 90% son microorganismos anaerobios estrictos, sin embargo la microbiota en la periodotitis apical pos-tratamiento está relacionada a microorganismos anaerobios y además a un microorganismo facultativo que ha ido tomado importancia durante los últimos años, el Enterococcus faecalis, responsable de la infección persistente (Álvarez, Alvial, Espinosa, Fuentes & Vallejo, 2013). Los Enterococos, Estreptococos y Lactobacilos son microorganismos grampositivos que se encuentran directamente relacionados con la mantención de la enfermedad postratamiento como lo han demostrado diversos estudios, estas bacterias son mucho más resistentes a la medicación intraconducto y tienen la capacidad de adaptarse a las condiciones más adversas que pueden presentarse en los conductos radiculares que han sido sometidos a preparación bioquímica (Álvarez et al., 2013). La medicina natural aunque ha sido utilizada en el tratamiento médico general para diversos tipos de dolencias desde muchos años atrás, es muy poco conocida como posible aporte en el ámbito odontológico; al respecto, existen investigaciones que analizaron el comportamiento de ciertos compuestos de origen vegetal sobre la bacteria Streptococcus

18 mutans, entre las que se pueden señalar las realizadas con aceite esencial de Melaleuca alternifolia "Te verde", extracto de Anacardium occidentale L. "Merey" y con la Matricaria recutita "Manzanilla alemana" como irrigante endodóncico, así también se realizaron estudios sobre varios aceites esenciales solos y/o combinados con la clorhexidina sobre cultivos bacterianos (Romero, Hernández & Gil, 2009). Durante siglos la manzanilla ha sido empleada como tratamiento coadyuvante en distintas enfermedades por sus propiedades antiinflamatorias, antioxidantes, astringentes, analgésicas, antiespasmódicas y sedativas, a su vez su principio activo ha sido probado en estudios in vitro los cuales han mostrado que tinturas de Matricaria chamomilla poseen efectos sobre ciertos microorganismos formadores de biofilm comparable al de la clorhexidina, por su parte estudios in vivo y en procedimientos clínicos han determinado que la infusión (té) de manzanilla es efectiva al utilizarla en enfermedades bucodentales relacionadas con procesos inflamatorios y/o infecciosos e incluso se la ha empleado en la elaboración de cremas, geles, colutorios y dentífricos (Gaete & Mella, 2012). El presente estudio se propone determinar la acción antibacteriana que posee el aceite esencial de manzanilla que podría ser utilizado como parte de una nueva generación de medicamentos intraconducto contando de esta manera con un nuevo recurso en el tratamiento de piezas dentarias con necrosis pulpar, disminuyendo las infecciones pos - tratamiento y trabajando con sustancias de origen natural vegetal de fácil disponibilidad en nuestro país. 2

19 CAPITULO I EL PROBLEMA 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Hoy en día dentro de la práctica odontológica la endodoncia se ha convertido en un método cotidiano a efecto de preservar las estructuras dentarias dentro de la cavidad bucal garantizando de esta manera el equilibrio del sistema estogmatognático. Si el tratamiento endodóncico no consigue que el conducto radicular esté libre de bacterias, o si la obturación final permite que nuevos microorganismos vuelvan a ingresar a este espacio que se encuentra limpio y sellado se puede producir una infección pos-tratamiento y de hecho se ha determinado que los microorganismos persistentes o reintroducidos son la principal causa de los fracasos. Dentro de los microorganismos persistentes se encuentra el Enterococcus faecalis un microorganismo muy resistente a los procedimientos de desinfección del conducto radicular que pueden mostrar variaciones en cuanto a su susceptibilidad al tratamiento y a los distintos materiales utilizados. Actualmente siendo la medicina natural una de las alternativas más empleadas en la población en general, el uso de plantas medicinales en la salud bucodental ha despertado el interés por sus distintas ventajas; fácil acceso, bajo costo e inocuidad; en razón de lo que antecede, nuestra investigación plantea como pregunta directriz, En qué medida el aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla ejerce un efecto antimicrobiano en comparación al Paramonoclorofenol Alcanforado y Gluconato de Clorhexidina al 2% aplicado sobre cepas de Enterococcus faecalis? 3

20 1.2 OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN Objetivo general: Establecer el efecto antimicrobiano del aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla en comparación al paramonoclorofenol alcanforado y gluconato de clorhexidina al 2% aplicado sobre cepas de Enterococcus faecalis al cabo de 24 y 48 horas de exposición Objetivos específicos: Registrar la medida de los halos de inhibición formados por el aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla al 25%, 50%, 75% y 100% en el cultivo bacteriano de Enterococcus faecalis. Establecer la medida de los halos de inhibición formados por el paramonoclorofenol alcanforado sobre el cultivo bacteriano de Enterococcus faecalis. Determinar la medida de los halos de inhibición formados por el gluconato de clorhexidina al 2% en el cultivo bacteriano de Enterococcus faecalis. Comparar estadísticamente las medidas de los halos de inhibición formados por el aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla al 25%, 50%, 75% y 100%, paramonoclorofenol alcanforado y gluconato de clorhexidina al 2% sobre el cultivo bacteriano de Enterococcus faecalis. 4

21 1.3 JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA Uno de los principales factores que ocasiona el fracaso pos-tratamiento es la presencia de microorganismos que han sobrevivido a la limpieza y preparación del conducto radicular o que han invadido los conductos por filtraciones en la corona de los dientes que han sido obturados, siendo el Enterococcus faecalis uno de los microorganismos más prevalentes. En la búsqueda por encontrar productos alternativos que puedan incorporarse e incluso permitan sustituir a los medicamentos ya conocidos, se han realizado diversas investigaciones que tienen como objetivo principal la utilización de plantas medicinales. Un efecto antimicrobiano del aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla sobre cepas de Enterococcus faecalis sería de gran relevancia clínica ya que podría ser utilizado como un agente antimicrobiano natural en el tratamiento de conductos radiculares infectados. 5

22 1.4 HIPÓTESIS El efecto antimicrobiano del aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla es mayor que el paramonoclorofenol alcanforado y gluconato de clorhexidina al 2% sobre cepas de Enterococcus faecalis. 6

23 CAPITULO II MARCO TEÓRICO 2.1 INFECCIONES ENDODÓNCICAS POS- TRATAMIENTO Participación microbiana en las infecciónes endodóncicas pos-tratamiento Las infecciones endodóncicas pos-tratamiento generalmente han sido asociadas a microorganismos persistentes al interior de los conductos radiculares, siendo identificado el Enterococcus faecalis como uno de los principales microorganismos asociados a las enfermedades periapicales crónicas así como de re-infecciones en el sistema de conductos luego del tratamiento, esto se debe a su capacidad para invadir los túbulos dentinarios y mantenerse viables dentro de estos, así como su capacidad para sobrevivir y multiplicarse en microambientes hostiles para cualquier otra bacteria (Pardi, Guilarte, Cardozo & Brizeño, 2009). Según Jara & Zubiate (2011) en las infecciones primarias generalmente existe una mayor cantidad de microorganismos al contrario de los dientes re-infectados que han sido sometidos a tratamientos endodóncicos previos los cuales presentan un grupo más reducido de microorganismos e incluso solo una especie (Tabla 1). Beer (1998), indica que después de la instrumentación, en el conducto radicular aún pueden quedar bacterias residuales que son responsables de síntomas dolorosos. Una administración sistémica de antibióticos no sustituye una instrumentación suficiente ni la aplicación oportuna de desinfectantes. Mediante los medicamentos aplicados dentro del conducto radicular deberían eliminarse todas las bacterias, reducirse la inflamación periapical y estimularse la neoformación de hueso. La tarea de las soluciones irrigantes y los rellenos temporales desinfectantes es, por lo tanto, también despegar y arrastrar fuera 7

24 del conducto los restos de tejido infectado ejerciendo simultáneamente una acción antimicrobiana. Tabla 1. Especies bacterianas aisladas en infecciones de la pulpa vital, infecciones de la pulpa necrótica e infecciones secundarias o persistentes. Microorganismos Microorganismos Microorganismos en infecciones de la en infecciones de la en infecciones pulpa vital pulpa necrótica secundarias o persistentes Staphylococcus Porphyromonas Enterococcus Enterococcus Prevotella Actinomyces Streptococcus Mitsuokella Streptococcus Eubacterium Fusobacterium Propionibacterium Actinomyces Selenomonas Sthaphylococcus Campylobacters Eubacterium Pseudomona Prevotella Peptostreptococcus Lactobacillus Capnocytophaga Veillonella Candida albicans Porphyromonas Treponema Treponemas Streptococcus Peptostreptococcus Enterococcus Eikenella Selenomas Lactobacillus Staphylococcus Campylobacter Eikenella Capnocytophaga Lactobacillus Actinomyces Fuente: Álvarez et al.,

25 A pesar de los esfuerzos por eliminar los microorganismos durante el tratamiento de endodoncia mediante los distintos procedimientos de desinfección utilizados aun pueden permanecer viables ciertos microorganismos residuales, sin embargo para que se produzca una re-infección es necesario que estos microorganismos resistan la instrumentaci ón, la irrigación y medicación intraconducto logrando adaptarse a condiciones extremadamente adversas (Hilú & Balandrano, 2009). Los microbios en el conducto radicular necrótico muestran gran variación en su susceptibilidad al tratamiento endodóncico y a los distintos materiales utilizados durante el procedimiento y en las obturaciones. Además, los cambios ecológicos desempeñan un papel fundamental en la selección de las especies que pueden sobrevivir en el conducto radicular. Las especies facultativas son más resistentes que las bacterias estrictamente anaeróbicas y las bacterias Gram-positivas sobreviven mejor que las Gram-negativas (De Lima, 2009). La microbiota en la cavidad bucal es muy compleja hasta el 2001 se tenía un registro de aproximadamente 500 especies bacterianas, actualmente se calcula que serían unas 700 (Negroni, 2009). Sin embargo según Álvarez et al. (2013) en la infección endodóncica el número de microorganismos es menor y su presencia al interior del conducto radicular depende de ciertas características entre las cuales se encuentran: a) Potencial de óxido reducción: antes de que se instaure el proceso infeccioso la cavidad pulpar ofrece condiciones apropiadas para los microorganismos que pueden subsistir en presencia de oxígeno, sin embargo conforme evoluciona el proceso infeccioso, aumentan los productos metabólicos y se reduce el aporte sanguíneo, la cantidad de oxígeno disminuye, lo que aumenta la presencia de microorganismos anaerobios. b) Cantidad suficiente de nutrientes: está directamente relacionado con su supervivencia y crecimiento. 9

26 c) Interacciones de sinergismo: se refiere a la elaboración de productos metabólicos que son sintetizados por un microorganismo y utilizados por otro u otros diferentes. d) Interacciones negativas o antagonismo: se refiere a la elaboración de sustancias inactivadoras por parte de un microorganismo que afectan a otro. De Lima (2009) menciona que en los dientes con tratamiento endodóncico, existe un espacio disponible limitado para los microbios, en consecuencia el conteo de UFC (Unidad Formadora de Colonias) obtenida en dientes endodóncicamente tratados son en promedio menores que el obtenido en dientes con periodontitis apical primaria. Siren & cols. (Citado por De Lima 2009), indican que se estudiaron 40 casos que fueron seleccionados para el cultivo bacteriano de infecciones endodóncicas persistentes y que contenían bacterias entéricas. El E. faecalis fue la forma más común (24 casos), seguida de la Enterobacter cloacae (5 casos). La infección endodóncica pos-tratamiento, por lo general, es asintomática u, ocasionalmente, muestra síntomas leves. Las posibles razones para este hecho pueden ser la ubicación de los microbios en el sistema de conductos radiculares (materiales obturadores y medicamentos ocupan la parte del espacio del conducto apical) y el porcentaje menor de bacterias anaeróbicas en estas infecciones. El Enterococcus faecalis está más relacionado con los casos asintomáticos que con los casos agudos. Es importante tener en mente que en la enfermedad endodóncica pos-tratamiento, algunos de los microbios residentes pudieron haber sobrevivido al tratamiento primario y así, se aíslan los «originales», ya que algunos penetraron en el espacio del conducto radicular más tarde en función de la asepsia durante el tratamiento, como la falla en la utilización del dique de goma, infiltración o material de sellado en una zona equivocada (De Lima, 2009). Cuando la necrosis pulpar es completa, las bacterias y sus toxinas, agentes inmunológicos y los productos de la degeneración pulpar alcanzan la zona perirradicular, 10

27 haciendo una comunicación directa con el periodonto. La interacción de estos irritantes de origen endodóncico y la defensa celular del huésped resulta en la liberación de mediadores inflamatorios a través del sistema de conductos radiculares. Estos mediadores son capaces de iniciar una reacción inmunológica en los tejidos periapicales que resulta en la formación de una lesión periapical (Fernández, Tobón, Osorno & Zuluaga, 2012) Causas del Fracaso en el tratamiento de endodoncia Según Cohen (2008) la microbiología endodóncica de los conductos tratados es menos conocida que la de las pulpas dentales no tratadas, infectadas y necrosadas. Esto podría ser, en parte, una consecuencia de la búsqueda de causas no microbianas, sino más bien de naturaleza puramente técnica, para explicar el fracaso de los tratamientos. Al contrario de las infecciones endodóncicas primarias, que se asocian predominantemente a gérmenes anaeróbicos mixtos, los fallos terapéuticos con frecuencia se relacionan con uno o dos microorganismos. En particular, el Enterococcus faecalis se aísla con frecuencia en dientes deteriorados sometidos a tratamiento del conducto radicular, y se sabe que es especialmente difícil de eliminar con la instrumentación y las técnicas de irrigación estándar (Cohen, 2008). Rodríguez (2003), menciona que para hablar de éxito no es suficiente con que el paciente esté contento y no aparezca por la consulta a quejarse, es necesario tener en cuenta los hallazgos clínicos y radiológicos en relación con la fecha de realización del tratamiento inicial. Debido a los mecanismos de reparación del hueso deberá transcurrir un tiempo antes de decidir si el caso ha sido resuelto. Actualmente la mayoría de las investigaciones están de acuerdo en que las revisiones deben realizarse en un periodo comprendido entre los seis meses y los dos años después del tratamiento, salvo ciertas excepciones. La presencia de dolor a la masticación, a la percusión o de forma espontánea, así como la persistencia o aparición de un trayecto fistuloso o la inflamación de los tejidos por motivos endodóncicos indican el fracaso del tratamiento (Rodríguez, 2003). 11

28 Además Cohen (2008) indica que el fracaso en la curación de una lesión perirradicular después del tratamiento endodóncico se relaciona, normalmente con la persistencia de microbios en el sistema de conductos radiculares que han accedido a los tejidos perirradiculares. Según Jara & Zubiate (2011), menciona que dentro de los principales errores que pueden presentarse son una inadecuada preparación durante la apertura cameral, limpieza y obturación del conducto, así como conductos no tratados e infectados, formación de escalones, grietas, perforaciones o fracturas del instrumental, sobre extensión del material obturador, obturación deficiente que no llega hacia el tercio apical, la presencia de filtración coronal por una inadecuada restauración y presencia de quistes. Dependiendo de su capacidad y habilidad para adaptarse y sobrevivir a un ambiente con condiciones extremadamente adversas dentro de las que se incluye la escases de nutrientes, serán factores que determinen la supervivencia de unas especies y la muerte de otras (Jara & Zubiate, 2011) Taxonomía y características generales del Enterococcus faecalis Los enterococos son cocos grampositivos que se disponen en parejas, crecen en medios usuales, son aerobios y anaerobios facultativos, generalmente no hemolíticos, catalasa negativos, crecen en caldo con 6,5% de NaCl, hidrolizan la esculina y crecen en 40% de sales biliares, además el Enterococcus faecalis ha sido reclasificado a partir de Streptococcus faecalis como un nuevo género (Prats, 2008). Los enterococos pueden dividirse según sus funciones metabólicas en cinco grupos que incluyen 19 especies, sin embargo el 80-90% de los aislamientos clínicos corresponden al Enterococcus faecalis, y el 5-10% al Enterococcus faecium, las 17 especies restantes se aíslan muy rara vez en patología humana (Prats, 2008). 12

29 Los enterococos pueden ser aislados de cavidad bucal y pueden actuar como microorganismos patógenos en infecciones del tracto urinario y en casos de endocarditis subaguda, además pueden originar infecciones intraabdominales, pélvicas y en neonatales (Díaz, Salas, Fernández & Martínez, 2007). Según Bazet, Blanco, Seija & Palacio (2005) los enterococos han pasado de ser considerados como microorganismos de baja patogenicidad a convertirse en una importante causa de infección hospitalaria, a pesar de su baja virulencia adquiriendo cada vez más importancia como patógenos nosocomiales. Fariñas & Torres (2007) mencionan que en Estados Unidos constituyen la tercera causa de infección hospitalaria y de bacteriemia mientras que en América Latina, ocupan el octavo lugar como causa de bacteriemia y el cuarto como causa de infección urinaria y de sitio quirúrgico. En los últimos veinte años han incrementado su frecuencia de aislamiento así como han ido adquiriendo mecanismos de resistencia a la mayoría de los antimicrobianos disponibles. Como resultado de esto, se han convertido en un reto para quienes se enfrentan al tratamiento de una infección grave causada por estos agentes (Bazet et al., 2005). Mediante técnicas basadas en cultivos, en los conductos radiculares se han aislado y clasificado con frecuencia especies que pertenecen a los géneros Actinomices, Enterococcus y Propionibacterium. La presencia de Enterococcus faecalis en casos de periodontitis apical pos-tratamiento es de particular interés y ha llamado la atención de diversos investigadores ya que raramente se observa en conductos radiculares infectados pero no tratados (Cohen, 2008) Factores de patogenicidad Para Álvarez et al. (2013) el Enterococcus faecalis es un microorganismo patógeno versátil que juega un papel importante en la etiología de las infecciones endodóncicas persistentes después del tratamiento inicial. Puede estar presente comúnmente en un alto número de fracasos de los tratamientos y encontrarse en un porcentaje de entre el 4% y 13

30 40% de las infecciones endodóncicas primarias, relacionándose más frecuentemente a lesiones perirradiculares crónicas asintomáticas que con periodontitis aguda o abscesos perirradiculares agudos (Fig. 1). Figura 1. A. Eliminación de barro dentinario B. Persistencia de E. faecalis luego del tratamiento Fuente. Álvarez, 2013 Álvarez et al. (2013) además indica que en lesiones perirradiculares persistentes, la frecuencia del E. faecalis es mucho mayor. Es más, en los tratamientos de endodoncia fallidos, es 9 veces más probable encontrar E. faecalis que en las infecciones primarias. Algunos estudios muestran una prevalencia de entre el 24% al 77% de este microorganismo en dientes tratados con lesiones periapicales. El gran rango de prevalencia puede ser explicado por las diferentes técnicas de identificación, diferencias geográficas o el tamaño de la muestra. Se aísla frecuentemente en infecciones endodóncicas refractarias gracias a una amplia variedad de factores de virulencia, entre los que se incluyen: enzimas líticos, citolisina, sustancias de agregación, feromonas y ácidos lipoprotéicos. A demás, el E. faecalis es capaz de suprimir la acción de los linfocitos lo cual contribuye potencialmente al fracaso del tratamiento de conducto (Arias, 2009). 14

31 Para Arias (2009) sin embargo, la resistencia de esta bacteria no depende tanto de sus factores de virulencia como de su capacidad para sobrevivir y persistir como patógeno en el interior de los conductos radiculares, lo que consigue por diversos motivos: Presenta una amplia variedad de polimorfismos genéticos. Su tamaño es lo suficientemente pequeño como para invadir así como vivir en los túbulos dentinarios. Puede subsistir largas temporadas de escasez de nutrientes y utilizar el suero como fuente de alimento. A demás el suero procedente del hueso alveolar y del ligamento periodontal le sirve de ayuda para unirse al colágeno tipo I. Resiste a la medicación intraconducto con hidróxido de calcio durante más de 10 días en el interior de los túbulos. Por último crece formando biopelículas siendo hasta 1000 veces más resistente a la fagocitosis, anticuerpos y antimicrobianos que cuando crece en forma planctónica. Por tanto, el E. faecalis se mantiene como una bacteria muy recalcitrante entre los potenciales agentes etiológicos de la periodontitis apical pos-tratamiento (Cohen, 2008) Forma de crecimiento Para Chávez de Paz (2009) los biofilms microbianos o biopelículas son la forma natural que utilizan las bacterias para sobrevivir y colonizar superficies en el medio ambiente. En la cavidad oral el más claro ejemplo de un biofilm microbiano natural es la placa dental. Los biofilms se han convertido en un área muy importante de investigación en endodoncia y en los últimos años se han producido muchos estudios en los cuales se ha resaltado la importancia de la eliminación de los biofilms del conducto radicular como parte de un tratamiento antimicrobiano más efectivo. 15

32 El término biofilme microbiano, define una estructura que asocia una o varias especies bacterianas, formada principalmente por polisacáridos auto-producidos y proteínas, en la que, los microorganismos y sus productos quedan adheridos a una superficie inerte ya se biológica o artificial (Sirvent & García, 2010). La masa polisacárida se parece a una armadura en la que los microorganismos permanecen retenidos y protegidos. Los microorganismos protegidos por esta matriz polisacárida, no sufren la acción química de las soluciones de irrigación, de los propios elementos de defensa orgánica, ni la acción de medicación antibiótica utilizada por vía sistémica. Sin embargo, el endodoncista por medio de la instrumentación del conducto radicular solamente logra remover los biofilmes localizados en la luz del conducto radicular, pero no aquellos que están localizados en los cráteres apicales, lo que justifica la necesidad de una conducta terapéutica que busque su eliminación, actualmente representada por el uso de medicación tópica entre sesiones (Leonardo, 2005). La capacidad del E. faecalis para crecer formando biopelículas en las paredes del conducto radicular ha sido demostrado in vitro, lo que le confiere mayor resistencia a la terapia endodóncica (Arias, 2009). Es decir que un biofilm puede llegar a tener una maquinaria coordinada con el fin de controlar el funcionamiento fisiológico celular en conjunto. Estas coordinaciones fisiológicas van a tener un propósito mayor: el de adaptarse al medio ambiente y a los cambios que en éste puedan ocurrir e incluso podrán controlar procesos más complejos como por ejemplo el metabolismo y distribución de nutrientes específicos y/o resistencia a agentes antimicrobianos (Chávez de Paz, 2009). Los biofilms moran en las zonas inalcanzables del sistema de conductos radiculares como istmos y ramificaciones. Cerca del 40% a 60% de los conductos aún tienen bacterias cultivables después de la preparación químico-mecánica con diferentes concentraciones de NaOCl. Esto es debido a que los instrumentos tienen un diseño y una rigidez que les permite actuar solo en el conducto principal y a que el NaOCl permanece en el conducto 16

33 por un periodo corto de tiempo, lo cual podría ser insuficiente para alcanzar otras áreas, incluyendo irregularidades, istmos, deltas apicales (Vivani, 2007). Cualquier microbio que infecte el conducto radicular puede desencadenar una reacción periapical. Aunque los constituyentes individuales de la flora endodóncica suelen tener baja virulencia, en conjunto actúan como patógenos debido a una combinación de factores que incluyen (Vivani, 2007): 1. Interacción con otros microorganismos presentes en el conducto que pueden conducir a sinergismo; 2. Liberación de endotoxinas; 3. Síntesis de enzimas que dañan los tejidos del huésped; y 4. Capacidad para interferir y anular las defensas del huésped. En este sentido, las bacterias que forman parte de las biopelículas son considerablemente más resistentes a agentes tóxicos que como célula individual (Arias, 2009). El mecanismo de formación de la lesión periapical es complejo. Las endotoxinas y enzimas de las bacterias ejercen función primordial, siendo responsables por las reacciones que potencian la infección, promueven la inhibición de la quimiotaxia de los neutrófilos y fagocitosis, garantizan la migración de enzimas lisosómicas, participan en la respuesta inmunológica por activación del sistema complementario, inducen la producción de anticuerpos, además de interferir en la sensibilidad antibiótica, dando como resultado la permanencia de lesiones periapicales dolorosas (Vivani, 2007). La evolución del biofilm es aun un misterio y no se conocen los mecanismos por los cuales las bacterias se asocian en biofilm. Lo que si se conoce es que la madurez del biofilm es directamente proporcional a su capacidad de defensa y a su resistencia a ser eliminado, por lo que, al día de hoy, la desinfección prematura del mismo o de las bacterias en suspensión que lo promueven parece ser un factor clave en el tratamiento (Sirvent & García, 2010). 17

34 Hay que recordar que no se puede saber clínicamente cuando se está tratando un biofilm, pero si se debe sospechar su existencia en dientes con necrosis de larga evolución o re - tratamientos. Por tanto, en estos casos, el tratamiento precoz será primordial para mejorar el pronóstico del caso, ya que el biofilm o no se habrá formado aun o estará en un estadío tan inicial que su capacidad de defensa es mínima (Sirvent & García, 2010). 2.2 SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS INTRACONDUCTO Medicamentos intraconductos La medicación intraconducto se refiere a la colocación de un medicamento en la cavidad pulpar que permita desinfectar está área durante el tratamiento. Los objetivos de la medicación, así como las sustancias y las técnicas utilizadas difieren entre sí en función de la situación clínica del diente en tratamiento (Soares, 2003). Durante años la medicación intraconducto ha tenido un papel importante en la terapia endodóncica para lograr la desinfección del sistema de conductos y posteriormente lograr el éxito del tratamiento (Canalda, 2006). Soares (2003), indica que la presencia de bacterias en dientes con pulpa viva es mínima y en este caso una limpieza adecuada garantizará la desinfección del conducto y la medicación intraconducto podría ser aplicada como coadyuvante para controlar la inflamación que pudo haber sido causada por el procedimiento. En los dientes que presentan una pulpa necrosada, la medicación intraconducto por el contrario será indispensable para la eliminación bacteriana sobre todo en aquellos lugares donde difícilmente puede llegar la instrumentación e irrigación (Soares, 2003). Debido a lo mencionado la medicación de selección debe tener un espectro amplio de acción y actuar por un período prolongado. También debe modular la inflamación de los 18

35 tejidos periapicales, responsables del proceso de reparación, neutralizar los restos orgánicos que puedan estar presentes; además de ayudar a secar los conductos persistentemente húmedos por el exudado (De Lima, 2009). Chong y Pitt Ford (citados por Canalda, 2006) han señalado ciertas características beneficiosas de la medicación temporal entre las que se encuentran: 1. Erradicación de las bacterias persistentes. 2. Inhibición de los residuos tóxicos producidos por los microorganismos. 3. Disminución de la inflamación periapical. 4. Reducción de los exudados periapicales. 5. Mecanismo de defensa en casos de infiltración de la obturación provisional. Soares (2003) por otro lado menciona que la elección de una medicación intraconducto necesita de ciertas consideraciones entre las que se destacan: a) Cantidad: se debe precisar la cantidad y concentración adecuadas del medicamento para asegurar el bienestar de los tejidos aledaños. b) Ubicación: es necesario conocer cómo funciona el medicamento para su aplicación, ya que algunos medicamentos pueden actuar a distancia u otros como el hidróxido de calcio pueden ejercer su acción por contacto. c) Tiempo de aplicación: es importante conocer cuánto tiempo puede permanecer viable el medicamento dentro del conducto. Es necesario tomar en cuenta que los medicamentos intraconducto también pueden provocar lesiones en los tejidos periapicales circundantes sanos (Soares, 2003). Para Canalda (2006) en el tratamiento de dientes infectados la medicación intraconducto puede ser utilizada por algunas razones: 19

36 1. Por la compleja morfología de los conductos radiculares que dificultan la instrumentación e incluso impide la llegada de los agentes irrigantes. 2. Para alcanzar zonas de depósito bacteriano producidas por la reabsorción apical. 3. Debido a los diversos estados pulpares y la presencia o ausencia de tratamientos previos, la microbiota en los conductos puede variar. 4. Asegura el éxito del tratamiento Paramonoclorofenol alcanforado Entre los antisépticos más usados en endodoncia se encuentra el p-monoclorofenol alcanforado (PMCC), que fue introducido por Walkhoff en 1929, siendo aplicado en las más variadas concentraciones y combinaciones para reducir sus efectos irritantes. A pesar de esto su uso ha ido decayendo por la utilización del hidróxido de calcio que ha mostrado efectividad antimicrobiana, buena tolerancia y biocompatibilidad con los tejidos vitales (Leonardo, 2005). El alcanfor que está presente en su composición tiene por fin disminuir la acción irritante del derivado fenólico resultando menos agresivo para los tejidos circundantes (Soares, 2003). Una sustancia que se use como medicación tópica entre sesiones en el tratamiento de dientes despulpados e infectados, debe tener propiedad bactericida y ser inocua para los tejidos periapicales. El PMCC, aunque sea efectivo como medicación bactericida, se considera poderoso agente citotóxico. Para Messer y Feigal, la acción citotóxica del p - monoclorofenol alcanforado, es superior a su acción bacteriana (Leonardo, 2005). Está comprobado que el efecto del PMCC desaparece en un 90% en las primeras 24 horas al impregnar un algodón y colocarlo en el conducto sin embargo su acción repercute no solo a nivel de conductos sino también en tejido periapicales aledaños e incluso se ha detectado su presencia en sangre y orina lo que indica una migración por vía sistémica (Canalda, 2006). 20

37 Como tiene elevada permeabilidad en razón de su baja tensión superficial, ese producto, teóricamente tiene acción a distancia. Así, por más que se quiera restringir su acción medicamentosa al conducto radicular, es imposible impedir su difusión hacia la re gión periapical (Leonardo, 2005). Hay una estrecha relación entre la tensión superficial de un antiséptico y su poder antibacteriano y, de acuerdo con Feirer y Leonard, cuanto más baja la tensión superficial del medicamento, más se difunde a través de la membrana de las bacterias, y en consecuencia más aumenta su poder bactericida. Así, desde el punto de vista de la penetrabilidad, la tensión superficial es de capital importancia, pues un medicamento penetra en los surcos y concavidades cuando es baja su tensión superficial (Leonardo, 2005) Mecanismo de acción del paramonoclorofenol alcanforado La presencia de alcanfor permite que la acción del medicamento, a través de la liberación progresiva de cloro naciente, presente una actividad más duradera disminuyendo la velocidad de liberación del PMC (más de dos semanas) (De Lima, 2009). Otro mecanismo de acción estaría relacionado con la coagulación de proteínas, pero esta circunstancia dificulta su remoción del conducto, justificando su utilización justo después de la conclusión de la preparación químico- quirúrgica (De Lima, 2009) Irrigación y Aspiración en endodoncia Según Arias (2009) para obtener conductos limpios y desinfectados es importante la irrigación que tienen por objetivos: a) Eliminar restos pulpares así como materiales creados durante la instrumentación entre otros, que puedan alterar la permeabilidad de los túbulos dentinarios. 21

38 b) Reducir la cantidad de bacterias e inhibir sus productos bacterianos. c) Facilitar el paso de los instrumentos y su acción de corte. Canalda (2006), indica que las propiedades deseables de una solución irrigadora se pueden resumir en las siguientes: 1. Capacidad para disolver los tejidos pulpares vitales y necróticos, tanto en la luz de los conductos principales como en todos los recovecos del sistema de conductos. 2. Baja tensión superficial para facilitar el flujo de la solución y la humectancia de las paredes de la dentina. 3. Escasa toxicidad para los tejidos vitales del periodonto, lo que entra en contradicción con su capacidad disolvente de los restos pulpares y con su acción antibacteriana. 4. Capacidad para desinfectar la luz y las paredes de los conductos, destruyendo las bacterias, sus componentes y cualquier sustancia de naturaleza antigénica. 5. Lubricación para facilitar el deslizamiento de los instrumentos y mejorar su capacidad de corte. 6. Capacidad para eliminar la capa residual de las paredes del conducto instrumentadas. No existe solución irrigadora ideal, por lo que para conseguir los objetivos me ncionados se debe combinar 2 o más Canalda (2006) Gluconato de Clorhexidina La clorhexidina (CHX) es un antimicrobiano de amplio espectro efectivo contra bacterias gramnegativas y grampositivas, así como hongos principalmente Candida albicans (Cohen, 2008). En 1954 fue utilizado por primera vez, como antiséptico para heridas de la piel, y en Odontología en 1959, en forma de enjuagues de gluconato de clorhexidina. Este agente 22

39 antimicrobiano ha sido utilizado de manera eficaz, en el control de enfermedades bucales en pacientes de edad y minusválidos, como también para reducir la cantidad de Streptococcus del grupo mutans, altamente sensibles a este agente, en el biofilm dental y en la saliva de niños y adultos (Leonardo, 2005). La clorhexidina (solución o gel) está siendo utilizada en endodoncia como irrigante y medicación intraconducto debido a su alto poder antimicrobiano, baja citotoxicidad y porque su efecto se mantiene por varias horas después de su aplicación (De Lima, 2009). La concentración más recomendada para la desinfección de conductos es del 2%, y al ser comparada con otras sustancias irrigantes generalmente con el hipoclorito de sodio, muestra un efecto antimicrobiano similar sin embargo la clorhexidina tiene la característica de continuar su liberación durante las 48 a 72 horas posteriores a la instrumentación por lo que además está siendo utilizada como medicamento intraconducto (Canalda, 2006). Además Schäfer y Bössmann y Sirén y cols. (citado por Canalda, 2006) encontraron que la clorhexidina al 2% resulto ser más eficaz que la combinación de hidróxido de calcio con paramonoclorofenol alcanforado frente a E. faecalis. El gluconato de clorhexidina al 2% ha demostrado un buen efecto sobre especies bacterianas anaerobias en el interior de los conductos radiculares. Gomes y cols. comprobaron que frente a Enterococcus faecalis el hipoclorito sódico al 5,25% era tan eficaz como el gluconato de clorhexidina al 2%. Önçag y cols. hallaron mayor eficacia antibacteriana con la solución de clorhexidina que con la de hipoclorito sódico a las concentraciones mencionadas, con una acción más rápida de la primera (Canalda, 2006). Esta sustancia ha sido utilizada por presentar acción antimicrobiana inmediata, amplio espectro antimicrobiano, relativa ausencia de toxicidad, capacidad de absorción por la dentina y lenta liberación de sustancia activa, lo que prolonga su actividad antimicrobiana residual (Leonardo, 2005). 23

40 Leonardo et al., evaluaron in vivo, la capacidad antimicrobiana y el efecto residual (sustantividad) del gluconato de clorhexidina al 2%, en el tratamiento de conductos radiculares de dientes humanos, con necrosis pulpar y lesión periapical crónica. Los autores concluyeron que la clorhexidina, como solución de irrigación presentó efecto antimicrobiano, siendo su sustantividad comprobada hasta 48 horas después de su utilización (Leonardo, 2005). Dado que el NaOCl es todavía el irrigante de elección, la eficacia antibacteriana de la CHX es comparada con éste. Los resultados de estos estudios no son concluyentes, pero en general no se ha reportado diferencia significativa entre estas dos sustancias. Al contrario del NaOCl, la CHX no tiene la propiedad de disolver tejido orgánico. Por tanto, el NaOCl es todavía considerado como la solución irrigante de primera elección (Basrani, 2009) Mecanismo de acción del gluconato de clorhexidina La gran afinidad de la clorhexidina por las bacterias, probablemente sea consecuencia de una interacción electrostática entre las moléculas de la misma, con carga positiva, y los grupos de la pared celular bacteriana con carga negativa. Esta interacción aumenta la permeabilidad de la pared celular bacteriana, permite la penetración de la CHX en el citoplasma del microorganismo, ocasionando su muerte (Leonardo, 2005). Dependiendo de su concentración, la CHX puede tener efecto bacteriostático y/o bactericida. En altas concentraciones actúa como un detergente, y al dañar la membrana celular causa precipitación del citoplasma y por tanto ejerce un efecto bactericida. En concentraciones bajas, la CHX es bacteriostática, produciendo la pérdida de sustancias de bajo peso molecular, como por ejemplo potasio y fósforo, lo que daña en forma reversible a la célula. También puede afectar el metabolismo celular de varias otras formas tal como el transporte de azúcar e inhibiendo la producción de ácidos en algunas bacterias (Sirvent & García, 2010). 24

41 2.3 Matricaria chamomilla MANZANILLA Plantas con acción antimicrobiana La utilización de sustancias naturales en el tratamiento de diferentes enfermedades, incluidas las de etiología infecciosa, constituyen en la actualidad un desafío en la medicina y se ofrece como una alternativa, especialmente en aquellas dolencias para las que no existe un remedio adecuado. Si se entiende por natural lo que el Diccionario de la Real Academia la define como aquello perteneciente o relativo a la naturaleza el termino engloba distintos aspectos (Domingo & López-Brea, 2003). Pero sin duda el reino vegetal es el que ofrece mayor variedad de sustancias potencialmente útiles aplicables en las enfermedades humanas, en concreto aquellas producidas por microorganismos. El nacimiento de la quimioterapia data de finales del siglo XIX y principios del XX y se relaciona con dos figuras claves en el desarrollo de la microbiología: Pasteur y Fleming. Sus trabajos resultaron fundamentales en el conocimiento de las enfermedades infecciosas y su tratamiento, pero el uso de compuestos naturales obtenidos de plantas data de mucho tiempo atrás (Domingo & López-Brea, 2003). Las plantas medicinales han sido utilizadas durante siglos como un método curativo siendo los países más pobres los que particularmente ha optado por esta alternativa debido a ciertas razones entre las que se destacan su bajo costo y la simplicidad para su elaboración (Sánchez, González & Lurá, 2006). La infusión es una de las formas como generalmente se utilizan y hoy en día su comercialización ha ido creciendo, algunas de las plantas que han sido utilizadas por sus efectos terapéuticos son: la malva, el propóleo, la ruda, estigma de maíz, boldo, manzanilla y menta (Sánchez et al., 2006). En nuestro medio algunas plantas medicinales en el área de salud dental están siendo utilizadas en diversas formulaciones farmacéuticas, así tenemos: los enjuagues buca les, 25

42 colutorios, soluciones tópicas, pasta dental, entre otros. Los beneficios que ofrecen a la población son mejores tanto en el aspecto terapéutico como económico (Calixto, 2006). La manzanilla (chamomilla) es considerada una planta medicinal y su eficacia curativa se conoce desde la antigüedad. Se ha reportado que un extracto de flor de manzanilla produjo in vitro una acción sobre el Streptococcus mutans, Pseudomona, Klebsiellas y Candidas (Gispert, Cantillo, Rivero & Oramas, 1998) Clasificación Botánica Familia: Asteraceae Género: Compositae Nombre científico: Matricaria chamomilla, Matricaria recutita Nombre común: Manzanilla (Cruz, 2009) Descripción Botánica La manzanilla se caracteriza por presentar una altura de aproximadamente 20 a 40 cm de alto, hojas color verde oscuro que presenta un botón floral de color amarillo y língulas de color blanco dorado, es oriunda de Europa sin embargo pudo ser llevada a México desde donde se ha extendido a toda América. Se caracteriza por presentar olor aromático característico y presentar sabor ligeramente amargo (Pardo & Morales, 2006) (Fig. 2). Figura 2. Matricaria chamomilla Fuente. La autora 26

43 2.3.4 Composición Química La principal parte de la planta son sus flores ya que aquí se encuentran los compuestos químicos que forman parte del aceite esencial entre los que sobresalen el camazuleno, el bisabolol y la apigenina, además presenta otros compuestos entre los cuales resaltan las cumarinas, flavonoides, antemidina, ácido antémico, matricina, taninos, ácidos grasos, carotenos, ácido ascórbico y ácido salicílico (Morón, Furones & Pinedo, 1996) Farmacología La manzanilla puede actúa principalmente como: antiinflamatorios, coleréticos, colagogos, sedantes y relajantes además presenta propiedades antisépticas y antiinfecciosas que están relacionadas con el contenido de aceites esenciales como el camazuleno y bisabolol, la presencia de flavonoides y matricina (Pardo & Morales, 2006). Además Pereira et al. (citado por Gaete & Mella, 2012) menciona que tinturas de manzanilla presentan efectos sobre algunos microorganismos que forman parte del biofilm y su efecto es similar al de la clorhexidina. También indica que sus propiedades antiinflamatorias se deben al mecanismo que impide la acción directa de la enzima COX -2. Por otra parte Romero et al. (2009) menciona que el principal mecanismo de acción de la manzanilla durante procesos infecciosos es la ruptura de la membrana celular la misma que puede ocurrir por tres razones: aumento de la permeabilidad, afectación de la estabilidad estructural y por consiguiente desestabilización de la bicapalipídica produciendo la lisis bacteriana Uso reportado Las hojas y flores son ampliamente usadas para tratar una gran variedad de males, tales como infecciones gastrointestinales (diarrea, dispepsia, flatulencia, gastralgia, gastritis, inflamación intestinal, parasitismo, indigestión, inapetencia), inflamación urinaria, 27

44 amigdalitis, cefalea, convulsiones, difteria, dismenorrea, gota, histeria, insomnio, lumbago, ictericia e hidropesía, nerviosismo y reumatismo (Cruz, 2009). Tópicamente la decocción se usa en compresas, cataplasmas y emplastos para t ratar afecciones dermatomucosas (hemorroides, hinchazón, llagas, raspones), inflamaciones, oftalmia, induraciones, tumores, cáncer y reumatismo (Cruz, 2009). Por vía oral se le atribuye propiedad anticatarral, antiemética, antiinflamatoria, aromática, calmante, carminativa, depurativa, diaforética, diurética, emenagoga, emoliente, espasmolítica, estimulante, expectorante, sedante, sudorífica y tónica, por vía tópica se le atribuye propiedad antiséptica, antiflojistica, antiiinflamatoria, cicatrizante y vul neraria (Cruz, 2009) Efectos adversos El manejo de sus flores puede producir dermatitis de contacto y reacciones alérgicas el uso excesivo de la infusión puede ser abortivo por ser un estimulante uterino, de donde está contraindicado en embarazadas (Cruz, 2009). 28

45 CAPITULO III METODOLOGÍA 3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN Según análisis y alcance de los resultados será un estudio de tipo experimental in vitro debido a que mediante la manipulación de una o varias variables y en condiciones controladas utilizaremos medios de cultivo que servirán para el desarrollo de las bacterias, manejadas en un laboratorio. Según la evolución del fenómeno estudiado será de tipo Longitudinal porque las variables de estudio serán observadas a lo largo de un tiempo determinado. Además será prospectivo porque los datos serán registrados conforme a la ocurrencia de los hechos. 3.2 MUESTRA DE ESTUDIO O POBLACIÓN Población Bacterias propias de la periodontitis apical persistente Muestra Cepas de Enterococcus faecalis (ATCC 19433) adquiridas en el laboratorio de microbiología farmacéutica de la Facultad de Ciencias Químicas (FCQ) de la Universidad Central del Ecuador (UCE) empleadas para evaluar el efecto inhibidor del aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla a diferentes concentraciones en comparación al paramonoclorofenol alcanforado y gluconato de clorhexidina al 2% en 15 placas petri (Fig.3). 29

46 Figura 3. Cepa de Enterococcus faecalis (ATCC 19433) Fuente. FCQ-UCE Elaboración. Autor 3.3 CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN Criterios de inclusión Bacterias anaerobias facultativas más frecuentes en periodontitis apical persistente. Bacterias que no se encuentren en contacto con sustancias antimicrobianas Criterios de exclusión Cepas que no pudieran ser reconstituidas en medio de cultivo. 30

47 3.4 OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES VARIABLES INDEPENDIENTES VARIABLE DEFINICIÓN DIMENSIONES NATURALEZA FORMA DE ESCALA DE INDICADOR CONCEPTUAL DE LA MEDICIÓN MEDICIÓN VARIABLE Aceite Mezcla de Diferentes Cuantitativa Directa Razón Concentración esencial de sustancias concentraciones (25%-50%- porcentual Matricaria orgánicas que se 75%-100%) chamomilla localizan en manzanilla determinados órganos de las plantas como hojas, flores y frutos. Gluconato de Antimicrobiano Una Cuantitativa Directa Razón (2%) Concentración clorhexidina de amplio concentración porcentual espectro efectivo contra bacterias gramnegativas y grampositivas, así como hongos. Paramonoclo Antiséptico usado Proporción Cuantitativa Directa Razón Concentración -rofenol como estándar (paramonoclo- proporcional. alcanforado medicación entre rofenol 35gsesiones en el alcanfor 65g) tratamiento de dientes despulpados e infectados. VARIABLE DEPENDIENTE VARIABLE DEFINICIÓN DIMENSIONES NATURALEZA FORMA DE ESCALA DE INDICADOR CONCEPTUAL DE LA MEDICIÓN MEDICIÓN VARIABLE Bacterias Especies Cepa estándar Cualitativa Directa Nominal Presencia de prevalentes bacterianas que ATCC los microorgaen patologías cumplen un Enterococcus nismos apicales papel faecalis aislados crónicas importante en el desarrollo de la infección endodóncica postratamiento. VARIABLE INTERVINIENTE VARIABLE DEFINICIÓN DIMENSIONES NATURALEZA FORMA DE ESCALA DE INDICADOR CONCEPTUAL DE LA MEDICIÓN MEDICIÓN VARIABLE Tiempo de Es la cantidad de Tiempo de acción Cuantitativa Directa Ordinal h exposición tiempo al cual antimicrobiana están expuestos los microorganismos a sustancias antimicrobianas. 31

48 3.5 PROCEDIMIENTO Y TÉCNICA Obtención del aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla La obtención del aceite esencial se efectuó en el laboratorio de análisis físicos, químicos y microbiológicos de la Facultad de Ingeniería en Ciencias Ambientales y Agropecuaria (FICAYA) de la Universidad Técnica del Norte (UTN)-Ibarra mediante el método por arrastre de vapor, decantación y purificación en rotavapor. Generalmente esta técnica se usa en la fabricación de perfumería además se caracteriza por que se pueden manejar grandes cantidades, ofrece una aceite esencial libre de impurezas y no requiere de equipos costosos y sofisticados. Este método se fundamenta en que la muestra vegetal es colocada en un balón de fondo plano para posteriormente poner la muestra en contacto con el vapor de agua que se obtiene por el sobrecalentamiento de aproximadamente 1 litro de agua que se encuentra en otro recipiente, de esta manera los aceites esenciales son arrastrados por la corriente de vapor de agua que se genera y puedan ser condensados, recolectados y separados de la parte acuosa. Para este procedimiento se recolectaron aproximadamente 2 kg de flores frescas de Matricaria chamomilla manzanilla las cuales fueron desecadas mediante exposición al sol para la posterior extracción del aceite esencial. Se procedió a colocar aproximadamente 150 g de flores secas en un balón de fondo plano para realizar el proceso antes señalado durante 4 horas. Después de lo cual se consiguió aproximadamente 3 ml del aceite esencial al 100% por cada destilación (Fig. 4 a, b, c). A B 32

49 Figura 4. A. Plantas de Matricaria chamomilla manzanilla B. Proceso de secado de la muestra vegetal C. Obtención de la esencia por arrastre de vapor de agua Fuente. FICAYA-UTN Elaboración. Autor C Preparación de las tres concentraciones del aceite esencial de Matricaria chamomilla (manzanilla) Finalmente el aceite esencial se depositó en un frasco oscuro cerrado herméticamente para su posterior uso en la preparación de las diferentes concentraciones (25%, 50% y 75%) mediante la utilización de tween 80 como agente coadyuvante de dilución (Fig. 5 a, b). A B Figura 5. A. Twen 80 agente coadyuvante de dilución B. Dilución del aceite esencial de manzanilla con Twen 80 al 50% de concentración Fuente. FICAYA-UTN Elaboración. Autor 33

50 3.5.3 Reactivación de la cepa bacteriana El estudio microbiológico se llevó a cabo en las instalaciones del laboratorio de microbiología farmacéutica de la Facultad de Ciencias Químicas (FCQ) de la Universidad Central del Ecuador (UCE). El medio Tryptic Soy Broth (TSB) fue utilizado para reactivar la cepa de Enterococcus faecalis (ATCC 19433) para lo cual se inoculó y posteriormente se incubó la cepa por 24 horas a 37 C confirmando su viabilidad por la presencia de crecimiento bacteriano (turbidez) en el caldo de cultivo (Fig. 6 a, b, c). A B C Figura 6. A. Medio Tryptic Soy Broth (TSB) B. Preparación del medio TSB y colocación en tubos de ensayo para su posterior esterilización C. Incubación de la cepa a 37 C por 24 horas Fuente. FCQ-UCE Elaboración. Autor 34

51 3.5.4 Preparación del Inóculo Se extrajeron 0,2 ml de la cepa reactivada y se colocaron en 2 ml de base Fosfato ph 7 en un tubo de ensayo, posteriormente se agitó el tubo por 5 minutos aproximadamente, observándose una turbidez de 0.5 en la escala de Mc. Farland, con el fin de poder apreciar mejor los halos de inhibición (Fig. 7). Figura 7. Escala de Mc Farland 0,5 Fuente. FCQ-UCE Elaboración. Autor Preparación del agar Mueller Hinton El medio de cultivo Mueller Hinton fue preparado según las instrucciones de la casa comercial, luego de lo cual fue esterilizado en autoclave, para luego repartir el medio en las 15 placas petri con un espesor de aproximadamente 4 mm por placa. Se dejó solidificar a temperatura de medio ambiente por 15 minutos y se marcaron las placas en la parte posterior con el nombre de la sustancia experimentales (aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla al 25%, 50%, 75% y 100%, paramonoclorofenol alcanforado, gluconato de clorhexidina al 2% y tween 80 (Fig. 8 a, b, c, d). 35

52 A B C D Figura 8. A. Agar Mueller Hinton B. Preparación del medio de cultivo C. Colocación del medio de cultivo Agar Mueller Hinton y medio TSB en la autoclave D. Medio de cultivo colocado en placas petri Fuente. FCQ-UCE Elaboración. Autor Siembra bacteriana Se procedió a tomar 0,2 ml de la suspensión bacteriana y se colocó en cada una de las placas petri que contenían agar Mueller Hinton, luego mediante la utilización del asa de digralsky se realizó la siembra de manera uniforme y en todas direcciones girando la placa (Fig. 9 a, b). 36

53 A B Figura 9. A. Colocación de la suspensión bacteriana en las placas petri B. Utilización del asa digralsky para la siembra bacteriana Fuente. FCQ- UCE Elaboración. Autor Técnica de difusión por pozos Se aplicó una técnica que consiste en hacer pozos en el agar utilizando un sacabocados de aproximadamente 6 mm de diámetro. Se realizó 5 pozos en 10 de las 15 placas petri y 4 pozos en las 5 placas restantes (Fig.10). Figura 10. Elaboración de los pozos con sacabocados Fuente. FCQ-UCE Elaboración. Autor 37

54 3.5.8 Grupos de estudio Grupo1 conformado por 5 placas petri en cada placa fueron elaborados 5 pozos y en cada pozo se colocaron las diferentes sustancias, aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla al 25%, 50% y 75%, paramonoclorofenol alcanforado y tween 80, el cual fue utilizado como control negativo asegurando la siembra bacteriana al no formar halos de inhibición. Grupo 2 conformado por 5 placas petri en cada placa fueron elaborados 5 pozos y en cada pozo se colocaron las diferentes sustancias, aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla al 25%, 50% y 75%, gluconato de clorhexidina al 2% y tween 80. Grupo 3 conformado por 5 placas petri en cada placa fueron elaborados 4 pozos y en cada pozo se colocaron las diferentes sustancias, aceite esencial de Matricaria chamomilla manzanilla al 100%, paramonoclorofenol alcanforado, gluconato de clorhexidina al 2% y tween Colocación de las sustancias experimentales en los pozos En cada pozo se colocaron 100 ul de las sustancias experimentales mediante una micropipeta, hasta quedar al mismo nivel del agar. Posteriormente se incubo el material a 37 C por 24 horas (Fig. 11 a, b). A 38

55 Figura 11. A. Sustancias antimicrobianas utilizadas en el estudio B. Colocación de sustancias con micropipeta Fuente. FCQ- UCE Elaboración. Autor B 3.6 RECOLECCIÓN DE DATOS Se realizó la medición individual de los halos de inhibición formados alrededor de cada pozo que contenían las sustancias experimentales mediante un calibrador vernier o regla pie de rey y una regla milimetrada registrando las medidas en mm. A las 24 y 48 horas de exposición se procedió a realizar las lecturas y el llenado de la tabla de recolección, tomando en cuenta: 1. Identificación de la muestra. 2. Identificación de la sustancia y concentración utilizada. 3. Medida en milímetros del halo de inhibición formado (Fig. 12 a, b, c, d). A 39

56 B C D Figura 12. A. Lectura de las medidas de los halos de inhibición B. Halos de inhibición formados a las 48 horas de exposición en el Grupo 1 C. Halos de inhibición formados a las 48 horas de exposición en el Grupo 2 D. Halos de inhibición formados a las 48 horas de Fuente. FCQ-UCE Elaboración. Autor 3.7 ASPECTOS ÉTICOS Se solicitó un informe técnico sobre la elaboración del aceite esencial de manzanilla en el laboratorio de análisis físicos, químicos y microbiológicos de la Facultad de Ingeniería en Ciencias Ambientales y Agropecuaria (FICAYA) de la Universidad Técnica del Norte (UTN)-Ibarra (Ver Anexo 1). Se solicitó un informe final en el cual se certificó la realización del trabajo práctico de esta investigación, efectuado en las instalaciones del laboratorio de microbiología farmacéutica de la Facultad de Ciencias Químicas (FCQ) de la Universidad Central del Ecuador (UCE), así como la facilitación de las cepas de Enterococcus faecalis (ATCC 19433) y la guía respectiva recibida por la profesora auxiliar de Microbiología farmacéutica (Ver anexo 2). 40

57 CAPITULO IV 4.1 DISEÑO Y ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS La presentación de resultados se elaboró mediante cuadros y gráficos. Las pruebas estadísticas más representativas fueron la T de Student, el análisis de varianza (ANOVA) y el test post Hoc de Bonferroni utilizando un nivel de significancia del 5%. Mediante los datos obtenidos (Ver Anexo 3) se realizó la base de datos en el programa estadístico SPSS 22, para estimar el valor medio del halo de inhibición para cada uno de los grupos de estudio. Tabla 2. Resultados del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 24 horas. Estadístico Gluconato Paramono- Manzanilla Manzanilla Manzanilla Manzanilla de clorofenol 25% 50% 75% 100% Clorhexidina Alcanforado Muestra Desviación 1,1 0,7 0,8 1,1 0,9 1,7 estándar Mínimo Mediana Máximo Fuente. Autor Elaboración. Ing. Juan Carlos Tuqueres Granja 41

58 Gráfico 1. Resultados del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 24 horas. Fuente. Autor Elaboración. Ing. Juan Carlos Tuqueres Granja Se observaron valores medianos similares para los grupos de gluconato, paramonoclorofenol y manzanilla al 100%, y valores bajos del halo de inhibición para las otras concentraciones de manzanilla. 42

59 Tabla 3. Resultados del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 48 horas. Estadístico Gluconato Paramono- Manzanilla Manzanilla Manzanilla Manzanilla de clorofenol 25% 50% 75% 100% Clorhexidina alcanforado Muestra Desviación 1,0 1,0 1,3 0,8 1,5 1,7 estándar Mínimo Mediana Máximo Fuente. Autor Elaboración. Ing. Juan Carlos Tuqueres Granja Gráfico 2. Resultados del halo de inhibición por grupo de estudio para tiempo de exposición de 48 horas. Fuente. Autor Elaboración. Ing. Juan Carlos Tuqueres Granja 43

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